Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
относительно дорогих реагентов.
4.2. Амперометрический иммуноферментный анализ
Более изящное использование щелочной фосфатазы как метки
продемонстрировано Дойлом и др. [3, 4]. В качестве модельного антигена
авторы использовали оросому-коид из сыворотки крови человека,
представляющий собой небольшой гликопротеин (молекулярный вес 41 ООО),
который имеет отношение к различным злокачественным образованиям [4] и,
по-видимому, связан с карциноэмбриональным антигеном. В этот белок
вводили метку щелочной фосфатазы. В системе проходила конкурентная
реакция между антителом к белку оросомукоида, иммобилизованным на
поверхности кюветы, и белком, меченным ферментом. Через соответствующий
промежуток времени кювету промывали и добавляли раствор субстрата-
фенилфосфата, который под действием
щелочной фосфатазы превращается в фенол:
АР
Фенилфосфат + Н20->Н3Р04 + Ph - ОН (4.7)
Сам субстрат щелочной фосфатазы, фенилфосфат, электрохимически неактивен,
а продукт реакции, фенол, активен, и его можно детектировать угольным
пастовым электродом жидкостного хроматографа. Этот метод, однако, требует
много времени, поскольку он включает 12-часовую инкубацию для протекания
конкурентной реакции; затем необходим еще 1 ч для накопления фенола в
количестве, достаточном для детектирования. С другой стороны, этот метод
исключительно чувствителен и может применяться уже при концентрации
субстрата 1 нг/мл.
В иммуноферментном методе часто используют антигены, меченные
дегидрогеназами. При этом образование NADH контролируют
спектрофотометрически. Прямое электрохимическое окисление NADH изучено
достаточно хорошо, и в работе [5] для определения NADH применяли не
спектроскопический, а электрохимический метод. Авторы [5] приспособили
серийную аппаратуру для определения фенитоина (низкомолекулярное
биологически активное вещество) с помощью проточно-инжекционного анализа.
Когда были приняты меры к предотвращению загрязнения электрода белками
сыворотки крови, удалось достичь хорошего согласия этого метода с
используемым в клинических лабораториях рутинным методом анализа
сыворотки (рис. 4.1).
4.3. Амперометрический иммуноанализ с использованием антигенов, меченных
электроактивными частицами
В 1979 г. две группы опубликовали сообщения о новом методе гомогенного
электрохимического иммуноанализа, в котором использовались антигены,
меченные электрохимически активными частицами. В обоих случаях
использовали небольшие модельные антигены. Уэбер и Пэрди [15] метили
морфин ферроценом. Авторы назвали свой метод вольтамперометрическим
иммуноанализом. В данном случае вели контроль за окислением ферроцен-
морфинового комплекса в присутствии и в отсутствие антител к морфину. Эта
реакция лежит в основе метода определения морфина в гомогенных условиях.
В присутствии антитела ток, связанный с окислением фер-роцен-морфиново! о
комплекса, уменьшается. Авторам удалось показать, что кодеин способен
вытеснять морфин из комплекса с антителом, в результате чего ток
окисления увеличивается. Уэбер и Пэрди [15] использовали потенциал + 500
мВ (отн. н. к. э.), поэтому могли окисляться и другие частицы, помимо
ферроцена в морфиновом комплексе; мешающее влияние, связанное с
восстановлением кислорода, отсутствует.
В описанном Хайнеманом и др. [8] методе гомогенного иммуноанализа антиген
эстриол метят ацетатом ртути и проводят его конкурентное связывание с
антителом. Отделения свободного эстриола от связанного не требуется,
поскольку в используемом диапазоне потенциалов эстриол неэлектроактивен.
Более того, связанный с антителом меченый антиген восстанавливается при
более отрицательном потенциале, чем свободный. Меченный ртутью эстриол
восстанавливается при - 300 мВ (отн. н. к. э.); чтобы избежать мешающего
влияния кислорода, пробы необходимо тщательно дегазировать. В противном
случае при низких концентрациях антигена чувствительность определения
снизится. В следующей работе группы Хайнемана [16] с эстриолом как
модельной системой электроактивность эстриола изменяли нитрованием. При
нитровании эстриола в положения 2 и 4 он становится электроактивным и
характеризуется волнами восстановления при - 422 и - 481 мВ относительно
хлоридсеребряного электрода сравнения. Это соединение авторы и
использовали в гомогенном иммуно-
Новые подходы в электрохимическом иммуноанализе
61
анализе. Рассмотренные методы гомогенного анализа с применением небольших
электроактивных антигенов трудно, однако, распространить на большие
белки.
Метод гетерогенного вольтамперометрического иммуноанализа больших молекул
разработан Дойлом и др. [3]. В качестве модели авторы использовали
сывороточный альбумин человека, модифицированный
диэтилентриаминпентауксусной кислотой (ДТПУ) и меченный индием (1п3+).
Применение индия как металла-метки может показаться экзотикой. Однако
обычно его не обнаруживают в заметных количествах в биологических
жидкостях, так что уровень фоновых значений весьма низок. Кроме того,
