Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
градуировочный график можно получить, преобразовав соответствующим
образом уравнение (30.4):
Cr/R = 1 + Кр[ А]. (30.6)
В этом случае измеряю! отношение сигналов в присутствии и в отсутствие
определяемого вещества. С такой ситуацией обычно приходится сталкиваться
при работе с сенсорами, основанными на принципе тушения флуоресценции.
При этом Кр является не истинной равновесной константой, а мерой
восприимчивости флуоресцирующего реагента к тушению, и зависит от
соотношения скоростей тушения и других процессов, связанных с
возбужденными состояниями.
Зависимость от количества иммобилизованного индикатора CR можно было бы
устранить, если бы удалось одновременно измерить как AR, так и R,
поскольку отношение этих двух величин прямо пропорционально концентрации
определяемого вещества:
AR/R = Кр[А]. (30.7)
Такая ситуация является предпочтительной. Фактически измерение R здесь
служит сигналом сравнения для определения AR, причем измеряемое отношение
не зависит от приборных флуктуаций и каких-либо изменений оптических
свойств реагента.
Поскольку реагент используется как индикатор, сигнал сенсора неизбежно
зависит от Кр. Чтобы реагент можно было использовать в оптическом
сенсоре, недостаточно только подходящих оптических характеристик, но и
значение Кр должно соответствовать диапазону определяемых концентраций (к
примеру, диапазон значений pH, измеряемых оптическим сенсором, зависит от
рКа иммобилизованного индикатора). Любая неконтролируемая переменная,
которая влияет на Кр, является источником погрешности. Так, поскольку
активность заряженных реагентов зависит от ионной силы, колебания
последней также могут быть источником погрешности. Кроме
непосредственного влияния на Кр могут иметь место и косвенные эффекты.
Например, колебания температуры и/или ионной силы могут воздействовать на
носитель иммобилизованного реагента (допустим, вызывая его набухание) и
тем самым влиять на Кр. Такие проблемы, естественно, желательно выявить
еще до оценки долговременных характеристик отклика оптических сенсоров в
практических целях.
В проведенном выше анализе предполагалось, что количество анализируемого
вещества, связанного с иммобилизованным реагентом, мало по сравнению с
общим содержанием этого вещества в пробе. В противном случае из-за
изменения концентрации анализируемого вещества могут возникнуть
систематические ошибки.
30.4.2. Конкурентное связывание
Концепция сенсора на основе конкурентного связывания впервые была
предложена в работе [22]. В сенсорах этого типа фаза иммобилизованного
реагента содержит как
480
Глава 30
селективный реагент, так и связанный с ним "лиганд". Добавление
определяемого вещества приводит к вытеснению лиганда из его комплекса с
реагентом:
А + LR ^ L + AR, (30.8)
где L-лиганд. Для протекания этой реакции необходимо, чтобы лиганд или
реагент находился в растворе. Молекулы компонента, находящегося в
растворе, должны быть большими (по сравнению с определяемым веществом),
так, чтобы его можно было иммобилизовать, физически удерживая мембраной,
селективно проницаемой для определяемого вещества за счет
соответствующего выбора размеров пор.
Измеряемый оптический параметр так или иначе связан с взаимодействием
лиганд - реагент. Первый описанный в литературе сенсор на основе
конкурентного связывания разрабатывали для определения глюкозы. В этом
приборе реагент, конканавалин А, иммобилизовали на внутренней поверхности
полой трубки, проницаемой для глюкозы [23]. Конец оптического волокна
помещали внутри полой трубки, при этом иммобилизованный конканавалин А
находился вне оптического пути. В результате меченный флуоресцирующим
веществом лиганд (декстран, меченный флуоресцеином) не возбуждается при
связывании с конканавалином А. Добавленная глюкоза замещает декстран,
позволяя ему диффундировать в область оптического пути, где флуоресцеин
возбуждается. Следовательно, увеличение содержания глюкозы сопровождается
увеличением наблюдаемого сигнала флуоресценции. Поскольку молекулы
декстрана слишком велики, чтобы проникнуть через стенки полой трубки, он
остается иммобилизованным.
В лаборатории, где работает автор, в настоящее время разрабатывают
сенсоры, в которых конкурентное связывание сочетается с флуоресцентным
переносом энергии. В этом случае лиганд содержит метку донора, а реагент
- акцептора (или наоборот). Подбирают возбуждающий свет с такой длиной
волны, чтобы селективно возбуждался только донор. Если лиганд связан с
реагентом, то расстояние между донором и акцептором так мало, что
возможен перенос энергии от донора к акцептору. При связывании
определяемого вещества с реагентом лиганд вытесняется, и расстояние между
донором и акцептором увеличивается настолько, что переноса энергии между
ними не происходит. Это приводит к увеличению испускания света донором и
уменьшению - акцептором. Измеряемой величиной является отношение
интенсивностей флуоресценции донора и акцептора. Для получения сигнала
