Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
свойствах фазы реагента будут влиять на интенсивность света, проходящего
через волокно. Кроме того, можно возбуждать флуоресценцию реагента на
поверхности волокна. Эту конфигурацию используют для иммуноанализа [27,
28], более подробно рассмотренного в гл. 33. Однако для многих приложений
эта конфигурация непригодна из-за того, что реагентом покрывают
относительно большую по длине часть волокна.
Фаза иммобилизованного реагента в оптическом сенсоре - в общем случае не
самая подходящая среда для спектрометрических измерений. Если реагент
иммобилизуют на твердых частицах, то падающий свет в значительной степени
рассеивается, как показано на рис. 30.1,а и б. Поскольку фазу
иммобилизованного реагента используют непрерывно, влияние оптической
неоднородности можно учесть при градуировке. Методика градуировки,
однако, будет проще и надежнее, если известно соотношение между
оптическим сигналом и определяемой величиной. В случае флуоресцентных
сенсоров обычно принимают, что интенсивность флуоресценции прямо
пропорциональна концентрации флуоресцирующего реагента. Хотя во многих
случаях это допущение, вероятно, справедливо, следует иметь в виду, что
может иметь место внутренняя фильтрация сигнала из-за поглощения
возбуждающего излучения иммобилизованным реагентом. Если изменение
концентрации флуоресцирующего агента сопровождается изменением в
поглощении фазы реагента, то величина эффекта внутреннего фильтра при
флуоресценции зависит от концентрации флуоресцирующего вещества, и
измеряемая интенсивность больше не пропорциональна концентрации.
478
Глава 30
Так, используя приведенные в литературе уравнения [35], можно рассчитать,
что при большом эффекте внутреннего фильтра отклик флуоресцентного
индикатора на pH существенно смещается.
В случае сенсоров, принцип действия которых основан на изменении окраски,
вывод теоретического соотношения между концентрацией поглощающего
вещества и измеряемой интенсивностью значительно более сложен. Во-первых,
не существует способа измерять интенсивность сигнала сравнения при той же
длине волны в отсутствие поглощающего вещества. Вместо сигнала сравнения
приходится использовать результаты измерений при другой длине волны, при
которой падающий свет не поглощается, либо пропускать свет по отдельному
оптическому пути, обходящему фазу реагента. Во-вторых, взаимодействие
падающего излучения с окрашенным реагентом включает как отражение, так и
поглощение. Хотя оптические сенсоры, основанные на изменении окраски, и
способны давать отклик, линейно зависящий от концентрации определяемого
вещества в относительно узком ее диапазоне [19], вывод количественного
соотношения между сигналом и концентрацией все еще остается проблемой.
Наряду со спектроскопическими факторами это является еще одной причиной,
почему по возможности предпочитают сенсоры, основанные на изменениях
флуоресцентного сигнала.
30.4. Выбор реагента
Иммобилизованный реагент в оптическом сенсоре может взаимодействовать с
определяемым веществом самыми разными способами, которые и будут
рассмотрены в этом разделе.
30.4.1. Индикатор
Реагент может служить индикатором, если он обратимо реагирует с
определяемым веществом с образованием продукта, оптические характеристики
которого отличаются от свойства несвязанного реагента. Этот подход
особенно привлекателен при измерении по возможности равновесного сигнала.
В большинстве описанных до настоящего времени оптических сенсоров
используются реагенты, действующие именно как индикаторы. Примером может
служить pH-сенсор, в котором реагент можно рассматривать как индикатор в
основной форме, определяемое вещество - это ионы водорода, а продукт-
протонированный индикатор.
Взаимодействие индикатора с определяемым веществом можно представить
уравнением
где А-определяемое вещество; R-реагент, AR- соединение с реагентом. Если
стехиометрия реакции выражается соотношением 1:1, то константа равновесия
равна
где R и AR-число молей свободного и связанного реагента в
иммобилизованной фазе соответственно. Предполагается, что коэффициенты
активности R и AR в иммобилизованной фазе одинаковы, и, таким образом,
они сокращаются.
Величины AR и R связаны с концентрацией определяемого вещества следующим
образом:
А + R AR,
(30.1)
Кр = AR/[A]R,
(30.2)
AR = Kp[A]CR/(l + Кр[А])
(30.3)
Оптические сенсоры на основе иммобилизованных реагентов
479
R = CR/(1 + Кр[ А]), (30.4)
где CR-общая концентрация свободного и связанного реагента:
CR = AR + R. (30.5)
Величина CR должна быть постоянной, поскольку постоянно число молей
реагента в иммобилизованной фазе.
Если измеренный оптический параметр пропорционален AR, то сигнал сенсора
пропорционален [А] при низких концентрациях ([А] "1 /К ) и постепенно
выходит на насыщение, достигая предельного значения при [А] "1 /К
Если же измеряемый параметр пропорционален R, то по мере добавления
определяемого вещества сигнал уменьшается. В этом случае линейный
