Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
возможно, и ферментных колонок) и соответствующего автоматического
переключателя. Однако и имеющаяся в настоящее время проточная система
великолепно обрабатывает ограниченное число проб, а в силу высокого
постоянства характеристик и короткого стартового периода является вполне
удовлетворительной дублирующей системой.
27.4.2.2. Определение L-аспарагина. Известны несколько ферментов, более
или менее селективно дезаминирующих различные аминокислоты. Примером
может служить L-аспарагиназа (ЕС 3.5.1.1):
L-Аспарагин + Н20 L~acndpari(tm)a3> L-аспартат + NH4 (27.8)
Если исследуемые пробы (например, пробы крови или сыворотки) обычно
содержат аммиак, то последний можно связать на поглощающей колонке с L-
глутаматде-гидрогеназой и затем определять другие образующие аммиак
соединения:
NH] + NADH + а-Кстоглутарат 1~~'лутама7Д%А' A D+ + L-глутамат (27.9)
гидрогеназа
Примером применения поглощающих колонок может служить методика
определения L-аспарагина в крови (сыворотке) [10]. Две последовательно
соединенные тефлоновые колонки (32 х 2 мм), содержащие 20 ед. L-
глутаматдегидрогеназы и 5 ед. L-аспараги-назы (иммобилизованных на
Эупергите С) соответственно, подсоединяют к проточной системе,
изображенной на рис. 27.6. В качестве буферного раствора применяют 0,05 М
Трис-HCl (pH 8,2), содержащий 1 мМ NADH, 0,5 мМ а-кетоглутаровой кислоты
и 3 мМ NaN3. При комнатной температуре колонка с L-глутаматдегидрогеназой
полностью связывает весь аммиак в пробах объемом 0,2 мл (0,5 мМ раствор
аммиака) при скорости потока 0,4 мл/мин и тем самым обеспечивает
удовлетворительный фон для разбавленных проб крови. Градуировочная кривая
определения L-аспарагина линейна до его концентрации 40 мкМ; изменение
напряжения составляет 0,8 мВ/мкМ. После анализа 20 проб колонки и трубки
промывают в течение 5 мин 0,1 М раствором фосфата калия (pH 7,0),
содержащим 0,8 М NaCl.
27.4.2.3. Определение креатинина. Недавно Винквистом и другими
разработана методика определения креатинина в сыворотке и моче [19]. В
этой методике с помощью конденсатора типа 1гМОП определяют аммиак,
образовавшийся при действии креатининиминогидролазы (креатининазы; ЕС
3.5.4.21), иммобилизованной на Эупергите С:
Креатинин + Н20 креатинина^>1Ч-метилгидантоин + NH3 (27.10)
Колонке с креатининазой предшествует колонка с L-глутаматдегидрогеназой,
связывающей эндогенные аммиак и ионы аммония. В качестве буферного
раствора применяли 0,05 М Трис НС1 (pH 8,5). Методика определения
креатинина не отличается от методики определения L-аспарагина. Если
используется колонка объемом 0,1 мл,
Биосенсоры па основе полупроводниковых газовых сенсоров
437
содержащая 6 м. ед. креатининазы (выпускаемой фирмой Aalto Bio Reagents
Ltd., Дублин, Ирландия), то при объеме проб 85 мкл линейная зависимость
отклика от концентрации сохраняется до концентрации 30 мкМ, а предел
обнаружения креатинина равен 0,2 мкМ. Весьма удовлетворительные
результаты получены при сравнении рассматриваемой методики с
применяющимися в настоящее время методами определения креатинина; так, в
пробах сыворотки (разбавленной в 25 раз) и мочи (разбавленной в 1000 раз)
содержание креатинина удалось определить с погрешностью около 3% без
каких-либо серьезных помех со стороны других содержащихся в пробах
веществ. Поскольку для анализа необходимо очень малое количество пробы,
методика может оказаться особенно ценной в педиатрии, хотя относительно
невысокая (15 проб в час) производительность системы затрудняет обработку
большого количества проб.
27.5. Заключение
В проточной аналитической системе с ферментным реактором (рис. 27.6)
изучали различные сочетания фермент-субстрат. Если активность реактора
достаточна для полного превращения субстрата, то из данного количества
субстрата образуется одно и то же количество аммиака независимо от
сочетания фермент-субстрат. Об этом свидетельствуют приведенные в табл.
27.2 данные, полученные при изучении раз-
Таблица 27.2. Отклик конденсатора со структурой 1гМОП на различные
сочетания фермент-субстрат. Буферный раствор 0,05 М ТрисНС1, pH 8,5.
Концентрация субстрата 10 мкМ в течение 30 с
Субстрат Фермент Продукты Изменение напряжения, мВ
Мочевина Уреаза С02 + 2NH3 16
L-Аспарагин Аспарагиназа Аспартат + NH3 8
L-Аспартат Аспартаза Фумарат + NH3 8
L-Глутамат Г лутамат дегидрогеназа а-Кетоглутарат + 8
NADH + NH3
Аденозин Аденозиндеаминаза Инозин + NH3 8
Креатинин Креатининиминогидро- N-Метилгидантоин + 8
лаза NH.
NH3 NH3 8
личных сочетаний такого рода в идентичных условиях. В случае мочевины
изменение напряжения в два раза выше, чем в случае других субстратов, так
как из одной молекулы мочевины образуются две молекулы аммиака. В табл.
27.3 указаны рабочие диапазоны некоторых NН3-продуцирующих систем в
условиях, описанных в предыдущем разделе.
Во введении мы обсудили преимущества и недостатки имеющихся сейчас
конструкций сенсоров, предназначенных для изучения газовой фазы. Во
