Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
брожения энтеробактерий и, следовательно, степень ингибирования
образования водорода является мерой чувствительности бактерий к
ампициллину. Почти во всех пробах в течение 5 ч удалось выяснить,
остались ли бактерии жизнеспособными в присутствии ампициллина.
Полученные результаты хорошо согласуются с выводами, достигнутыми с
помощью обычного метода диффузии в агаровом диске. Эти результаты
свидетельствуют о том, что определение продуцируемого водорода может
стать полезным, простым и быстрым методом оценки устойчивости
микроорганизмов к антибиотикам.
Недавно ХерЪстен и другие с помощью сенсора для оценки продуцирования
водорода [15] исследовали устойчивость к ампициллину штамма Е. coli,
вызывающего заражение мочевых путей [14]; параллельно определяли три
других параметра системы, в том числе выделение тепла с помощью
ферментного термистора [16] (см. также гл. 29), внутриклеточную
концентрацию АТР и образование кислот и оснований.
Время, v
Рис. 27.8. Выделение водорода и тепла в анаэробной культуре Е. coli в
присутствии ампициллина в минимальной ингибирующей концентрации (4 мг/л)
и в отсутствие ампициллина. Кривые (-- .-- -.-) и (..) - термограммы
в присутствии и в отсутствие ампициллина соответственно;
кривые (......)-и (----------)- концентрация водорода в
присутствии и в отсутствие
ампициллина соответственно.
г
f
Биосенсоры на основе полупроводниковых газовых сенсоров
433
Выделение водорода, тепла, образование кислот и оснований определяли в
реальном масштабе времени в суспензионных культурах Е. coli (2-2,5 л) в
различных средах в зависимости от количества добавленного ампициллина.
Водород отбирали перистальтическим насосом через регулируемый таймером
соленоидный клапан и разбавляли воздухом, как это описано выше (см. разд.
27.3). Оказалось, что все четыре определения дают ценную информацию.
Очевидно, что даже два различных определения повышают надежность
результатов. Легко осуществляемый с помощью сравнительно простых методик
и устройств контроль продуцирования водорода в ходе культивирования дает
четкую картину устойчивости культуры к антибиотику. На рис. 27.8
представлены результаты двух сравнительных экспериментов в отсутствие
ампициллина и в присутствии этого антибиотика.
27.4.1.1. Гидрогеназа. Аналитическая система, схема которой изображена
на рис. 27.5, может быть применена для определения NADH и NAD + , если ее
дополнить небольшими реакционными колонками, содержащими около 1 мл
гидрогеназы (HDH), иммобилизованной на пористом стекле с регулируемым
размером пор. Раствор NADH (0,5 мл) вводили в поток буферного раствора
Трис ¦ НС1 (pH 8,0) и выделяющийся в катализируемой HDH реакции водород
определяли с помощью РбМОППТ. Градуировочная кривая линейна до
концентрации NADH 0,5 мМ и в этом диапазоне описывается уравнением
cnadh(mkM) = 0,1ДГ(мВ); предел обнаружения NADH равен 0,03 мМ. Система
позволяет анализировать по меньшей мере 10 проб в час [3].
Эту же систему можно применить для определения NAD + , воспользовавшись
катализируемой HDH обратной реакцией, в которой расходуется Н2. В этом
случае к буферному раствору добавляли 100• 10~4% Н2 и 0,1 мМ NADH.
Калибровочная кривая линейна в диапазоне 0,05-0,6 мМ. Далее с целью
расширения сферы применения водородных сенсоров мы изучали сочетания
различных дегидрогеназ и HDH. Например, этанол можно определять с помощью
следующей последовательности реакций:
С2Н5ОН + NAD+ ^ NADH + Н ' ^NAD+ + Н (27.5)
-СН3СНО
Здесь ADH-алкогольдегидрогеназа. Интересна методика непосредственного
определения летучих субстратов дегидрогеназ в газовых пробах с помощью
совместно иммобилизованных дегидрогеназы и HDH, находящихся во "влажной"
колонке, насыщенной буферным раствором и коферментом. В этой методике
пробу вводят в поток газа-носителя, который переносит образующийся в
реакционной колонке водород к детектору типа РбМОП. В предварительных
экспериментах с парами этанола и альдегида получены обнадеживающие
результаты.
Поскольку иммобилизованная HDH сравнительно устойчива, а реакционная
смесь не загрязняется никакими субстратами и продуктами, кроме Н2 и Н + ,
представляется реальной и регенерация кофермента. Мы показали, что
непрерывная регенерация NADH действительно осуществляется в системе, в
которой иммобилизованные ала-ниндегидрогеназа и HDH превращают пируват в
аланин [17]:
. .... \.-алакиядееидрогенаэа
Пирубат. + NH3 ----_ - -------------> L-crjza/tu/г
NADH NAD+
H+ <- ---- ---------- H2
HDH
Можно надеяться, что подобная система регенерации кофермента будет
использоваться в сочетании с сенсорами типа PdMOU для усиления сигнала
последних аналогично тому, как Шеллеру и сотрудникам [18] удалось усилить
сигнал фермент-
28- 1145
434
Глава 27
ного термистора с помощью субстратных амплифицирующих систем. Реализация
такого усиления сигнала должна привести к созданию чрезвычайно
высокочувствительных методик.
27.4.2. Аналитические системы на основе определения NH3
