Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
катализируемый инвертазой (ЕС 3.2.26) гидролиз сахарозы и последующее
окисление глюкозы с образованием электрохимически активных частиц [5, 27,
34]. Поскольку GOD превращает только (3-форму глюкозы, соиммобилизация
мутаротазы (ЕС
5.1.3.3), ускоряющей превращение исходно образующейся а-глюкозы в (3-
форму, приводит к почти десятикратному повышению чувствительности, так
как в присутствии фермента скорость мутаротации выше, чем в случае
спонтанной реакции. При этом, однако, во столько же раз сужается диапазон
линейности сенсора [10, 58].
Методика определения сахарозы на анализаторе YSI та же, что и для
глюкозы, за исключением того, что требуется установить мембрану с
соиммобилизованными инвертазой, мутаротазой и глюкозооксидазой. Измерение
длится около 60 с, что связано с необходимостью достижения стационарного
состояния. Вклады раффинозы и мелибиозы в показания прибора составляют
соответственно 2 и 8%. Диапазон линейности для сенсора простирается до 90
ммоль/л, обычный срок службы мембраны-10 дней. Поскольку конечная
ферментативная реакция здесь та же, что и при определении глюкозы,
содержание последней в пробе влияет на результат определения сахарозы.
Для таких проб фирма YSI рекомендует определять суммарное количество
глюкозы и сахарозы и отдельно содержание глюкозы, используя "сахарозную"
и просто "глюкозную" мембраны соответственно. Этот метод, очевидно, не
очень удобен, поскольку требуется менять мембраны в ходе анализа. Более
удобно проводить инверсию сахарозы вне измерительной ячейки, используя
растворимую ин-вертазу и измеряя содержание глюкозы до и после этой
процедуры.
Проблему влияния глюкозы на определение сахарозы можно решить, превратив
глюкозу в другие, не мешающие продукты с помощью GOD и каталазы. С этой
целью индикаторный ферментный слой покрывают защитным слоем, содержащим
GOD и каталазу (ЕС 1.11.1.6). Проникающая в этот слой p-D-глюкоза
полностью разлагается. При использовании защитного слоя на определение
сахарозы не влияет эндогенная глюкоза, если ее концентрация в
измерительной ячейке не превышает 2 ммоль/л [60].
264
Глава IS
Таким способом с помощью прибора Glukometer была непосредственно
определена концентрация сахарозы в соке сахарной свеклы или растворимом
какао [60]. Этот принцип используют и для устранения мешающего влияния
других веществ, например лактата.
18.2.1.10. Лактат. У многих тяжело больных пациентов в результате
дыхательных, гемодинамических и метаболических отклонений от нормы
развивается ацидоз. Повышенное содержание лактата в плазме обычно связано
с метаболическими нарушениями, приводящими к ацидозу, сопровождаемому, в
частности, сосудистым коллапсом. Определение L-лактата в крови важно для
того, чтобы отличить молочнокислый ацидоз от других случаев ацидоза, а
также для последующего лечения. Специфической областью, в которой
требуется быстрое и точное определение лактата в крови, является контроль
за нагрузками спортсменов в спортивной медицине. Кроме того, определение
концентрации лактата в цереброспинальной жидкости помогает отличить
вирусный менингит от гнойного и установить церебральную кислородную
недостаточность. Справочные значения концентрации лактата в крови и
вытяжке составляют соответственно меньше 2,7 и 1,2-2,1 ммоль/л.
Результаты определения лактата в сыворотке не отражают его истинной
концентрации в крови, поскольку чем больше время между взятием пробы
крови и выделением из нее форменных элементов, тем. выше концентрация
лактата в. сыворотке.
Для определения L-лактата с помощью амперометрических биосенсоров
пригодны четыре различных фермента: лактатдегидрогеназа (LDH, ЕС
1.1.1.27), цитохром Ь2 (ЕС 1.1.2.3), лактатоксидаза (LOD, ЕС 1.1.3.2) и
лактатмонооксигеназа (LMO, ЕС 1.13.12.4). Каталитические реакции,
осуществляемые этими ферментами, можно представить следующей схемой:
LDH
NAD+ + 2(Fe(CN)6)3 + Ог +
СН3 НС-ОН
I
соон
Цитохром Ьг
L0D
СН3
I
с=о
I
соон
+ Н+ + NADH + 2Н+ + 2(Fe(CN)6)*' + H2O2
VLMO
СН3
СООН
+ С03 ч- HgO
Реакцию LDH можно сопрягать с редокс-электродами путем анодного окисления
NADH либо непосредственно [6, 8, 31, 80], либо через электронные
медиаторы, например феназинметосульфат [35] или флавинмононуклеотид [69].
Знакомство с этими сенсорами позволяет глубже вникнуть в проблемы
регенерации электрохимически активного кофактора и медиаторного переноса
электрона. Однако они непригодны для рутинного использования, прежде
всего из-за загрязнения электрода продуктами окисления NADH или
медиатора.
В биосенсорах на основе LMO (декарбоксилирующий фермент, часто называемый
лактатоксидазой) иммобилизованный фермент закрепляют на поверхности
кислородного электрода Кларка [36, 62]. Для такого сенсора авторы [36]
получили линейную зависимость сигнала от концентрации при содержании
лактата в измерительной ячейке до 0,25 ммоль/л. Для образцов
реконструированных сывороток крови человека коэффициент корреляции между
