Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
Для идентификации бактерий использовали морфологические и биохимические методы. В ряде случаев определяли нуклеотидную последовательность гена 16S г РНК. Для выявления отличий между некоторыми штаммами сравнивали структуры их повторяющихся межгенных палиндромных последовательностей (метод REP-PCR).
Грамотрицательные Hg-r-бактерии нашей коллекции относятся преимущественно к трем систематическим группам у-подкласса: Acinetobacter (около 50 штаммов), Pseuaomonadaceae (около 100 штаммов), Enterobacteriaceae (около 50 штаммов).
Грамположительные Hg-r-бактерии являются представителями обеих эволюционных ветвей этих бактерий - групп с высоким \Arthrobacter, Mycobacterium, Micrococcus, Rhodococcus, Citreobacterium) и низким (Bacillus, Exiguobacterium) содержанием Г + Ц в ДНК. Они были выделены из грунта Закарпатья, Подмосковья, Средней Азии, Камчатки и Курильских островов (всего около 60 штаммов).
2.2. ВЫДЕЛЕНИЕ ОПЕРОНОВ И ТРАНСПОЗОНОВ РТУТНОЙ УСТОЙЧИВОСТИ
Как упоминалось выше, устойчивость бактерий к соединениям ртути может обеспечиваться не только присутствием тег-оперонов, но и другими механизмами, например способностью синтезировать сероводород, как у бактерий в коллекции Треворса (Belliveau et al., 1991). Поэтому на первом этапе работы в результате анализа почти 150 штаммов грамотрицальных и грамположительных бактерий мы отобрали Hg-r штаммы, несущие тег-опе-роны. О присутствии у бактерий тяег-оперонов судили по активности кодируемых ими ферментов ртуть-редуктаз.
В дальнейшем поиск оперонов и транспозонов устойчивости к ртути проводили двумя способами:
1) методом гибридизации по Саузерну: колонии бактерий или ДНК, выделенную из Hg-r-штаммов, гибридизовали с фрагментами тяег-оперонов или транспозонов в качестве специфических зондов. Затем гаег-опероны вместе с прилегающими к ним участками ДНК клонировали или ПЦР-амп-лифицировали и определяли их нуклеотидные последовательности.
2) путем выделения активных транспозонов с помощью плазмид широкого круга хозяев, переноса возникших гибридных плазмид в клетки Escherichia coli и последующего их перемещения на векторные плазмиды. Этот метод позволяет не только находить ранее неизвестные транспозоны, но и исследовать распространение как самих транспозонов, так и их составных элементов. Тем не менее этот метод практически не использовался в работах зарубежных лабораторий.
5. Проблемы и перспективы...
129
2.3. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ тег-ОПЕРОНОВ
И РТУТНЫХ ТРАНСПОЗОНОВ
В настоящее время молекулярно-генетическая структура /?гег-оперонов и функции генов, входящих в их состав, в основном выяснены. Показано, что они кодируют регуляторные белки, белки транспорта иона ртути внутрь клетки, фермент ртуть-редуктазу, восстанавливающую ионы ртути в металлическую ртуть, и фермент органомеркуриат-лиазу, гидролизующую органические соединения ртути (обзоры: Summers, 1986; Silver, Phung, 1996; Hobman, Brown, 1997). Среди генов, входящих в состав лгсег-оперона, различают гены, строго необходимые для его функционирования {mer R, Т, Р и А) (рис. 40), и гены дополнительные {mer С, F, В, D, G, Е и urf2). Первые обязательно присутствуют во всех оперонах; вторые встречаются в них в различных сочетаниях (Osborn et al., 1993,1995, 1996,1997; Reniero et al., 1998; Silver, Phung, 1996; Hobman, Brown, 1997; Liebert et al., 1997; Bogdanova et al., 1998; Gupta et al.. 1999; Huang Ch.-Ch. et al., 1999b; Kiyono et al., 1999; Mindlin et al., 2001).
Бактерии, содержащие гаег-оперон без гена merB (опероны узкого спектра), устойчивы только к неорганическим соединениям ртути. Ген тег В обеспечивает устойчивость бактерий и к органомеркуриатам (опероны широкого спектра) (Kiyono et al., 1995, 1997; обзоры: Silver, Phung, 1996; Hobman, Brown, 1997).
Некоторые штаммы могут содержать два или три отличающихся по своей структуре тег-оперона (Griffin et al., 1987; Inoue et al., 1991, Kiyono et al., 1995).
Транспозоны, несущие mer-опероны, широко распространены среди клинических штаммов бактерий. Первые из описанных транспозонов этой группы, Тп501 (рис. 40) и Тп27 были исследованы особенно подробно и полностью секвенированы. Предполагают, что они произошли от более просто организованных ртутных транспозонов, возникших первоначально у бактерий окружающей среды (Liebert et al., 1999).
3. ГОРИЗОНТАЛЬНЫЙ ПЕРЕНОС ГЕНОВ МЕЖДУ РАЗЛИЧНЫМИ БАКТЕРИЯМИ 3.1. МЕТОДЫ ТЕСТИРОВАНИЯ ГПГ
По мере развития и совершенствования методов молекулярной биологии происходило и повышение уровня достоверности при определении фактов ГПГ. На первых этапах, помимо анализа фенотипических признаков, использовали метод сравнительного изучения полиморфизма ферментов; в настоящее время основным методом является секвенирование (полное или частичное) геномов различных организмов и их сравнительный анализ.
В наших исследованиях мы использовали два способа доказательства фактов ГПГ:
1) когда, при относительно недавнем переносе (в масштабах эволюции), у неродственных бактерий удается обнаружить очень сходные нуклеотидные последовательности (менее 0,5% нуклеотидных замен): блоки генов, от-
