Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
51
сказанных генов дрозофилы. Кроме того, остаются не охарактеризованными разнообразные регуляторные и структурные элементы генома, обеспечивающие надежную работу генов и генома как целого.
Наш подход заключается в выявлении закономерностей и особенностей функционирования генома на основе подробного исследования структурнофункциональной организации небольшой, но репрезентативной части генома. Для такого исследования был выбран район 2DF Х-хромосомы (по цитологической карте политенных хромосом дрозофилы) длиной 200 т.п.н.. Данный район - один из наиболее подробно изученных генетическими методами участков генома (ссылки см.: Alatortsev, 1997а), а большинство генов района были детально охарактеризованы структурно и функционально молекулярными методами. Район содержит несколько десятков генов и около десяти структурных элементов хромосомы - хромомеров. Как часть Х-хромосомы район подвергается дозовой компенсации - двукратному увеличению активности генов Х-хромосомы у самцов, несущих одну Х-хромосому, по сравнению с самками, имеющими две Х-хромосомы. Для изучаемого района получены хромосомные перестройки, в которых гены района перенесены к прицентромерному гетерохроматину, что позволяет изучать взаимодействия между эу- и гетерохроматином в геноме дрозофилы.
КОМПАКТНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ
Сколько всего транскриптов (генов) присутствует в исследуемом протяженном районе генома? Есть ли какие-либо взаимодействия при транскрипции соседних генов? Для ответов на эти и другие вопросы, связанные с организацией синтеза РНК в данном районе, предварительно были клонированы в космидах фрагменты ДНК района 2DF и построена рестриктная карта района (Алаторцев, 1987, 1988). В дальнейшем были охарактеризованы 10 генов данного района (Фролов, Алаторцев, 1993а, б; Frolov, Alatortsev, 1994; Frolov, Zverlov, Alatortsev, 1994; Alatortsev et al., 1997; Алаторцев и др., 1998; Алаторцев и др., 2000). Еще 12 генов района были исследованы в разное время в других лабораториях, подробную информацию о генах района можно найти в базе данных FlyBase. Полный геномный сиквенс данного района, полученный Европейским консорциумом из 10 лабораторий (Benos et al., 2000) и компанией Целера Геномике (Adams еу al., 2000), позволил предсказать еще ряд генов в данном районе. Однако предсказаны были только участки, кодирующие белки, сведения о полных транскриптах отсутствовали. Кроме того, эти предсказания нуждались в экспериментальном подтверждении, так как сравнение двух аннотаций геномного сиквенса показало, что для 40% предсказанных кодирующих последовательностей ДНК наблюдаются определенные различия, причем в 9% случаев предсказания не соответствовали друг другу (Benos et al., 2000).
Использование геномного сиквенса помогло нам построить подробную транскриптную карту для изучаемого района. Для поиска новых РНК, соответствующих как предсказанным генам, так и, возможно, синтезируемых в протяженных участках между известными ранее генами района, было сконструировано несколько десятков уникальных праймеров. Новые кДНК обнаруживали с помощью полимеразной цепной реакции с использованием суммарной кДНК дрозофилы, полученной с олиго-дТ-затравки, и синтези-
52
1. Тандемная транскрипция Cyp4d2 Сур4е4 рп
cm 30В8.3 10330 30В8.6 2567
2. Ген в интроне
Mcll 11715
103В4.2 9145
3. Перекрывание 3-концов транскриптов рп 0r2F
Nmd3 crn
4. Перекрывание 5-концов генов
К10 25Е8.3
kz 2567
Рис. 18. Примеры компактной организации экспрессии соседних генов в районе 2DF Х-хромосомы дрозофилы
Стрелки показывают относительное расположение и направление транскрипции отдельных генов
рованных геном-специфических праймеров. Продукты амплификации, представляющие собой новые кДНК из района 2EF, были клонированы и сиквенированы. В результате в районе были картированы в общей сложности 40 транскриптов или генов (рис. 17). Были уточнены не только структуры транскриптов, но и само существование некоторых предсказанных генов. Так, транскрипты предсказанного in silico на участке ДНК 180-182 т.п.н. гена EG:25E8.6 не были обнаружены, однако точно в месте расположения данного предполагаемого гена несколькими независимыми экспериментальными методами нами был обнаружен совершенно другой, новый ген дрозофилы, названный Vml. Транскрипция гена Vml идет в сторону, противоположную предсказанной, и он кодирует новый белок, имеющий сходство с белками вителлиновой мембраны ооцита дрозофилы.
В среднем на один ген в исследуемом нами районе приходится 5 т.п.н.. Размеры транскрибируемых областей варьируют от 0,3 до 20 т.п.н.. Как правило, гены расположены вплотную, с минимальными межгенными расстояниями. Транскрипты могут располагаться тандемно, с перекрыванием З'-концов или с перекрыванием 5'-концов (рис. 18). Более того, в районе
53
есть два гена, EG.103B4.2 и 11715, полностью расположенные в интронах других генов. Обнаружение перекрывающихся районов транскрипции поднимает вопрос о функциональной взаиморегуляции обнаруженных генов.
Картирование транскриптов для протяженного района генома дрозофилы, содержащего 40 генов, осуществлено впервые. Интересно, что плотность транскриптов в исследованном ранее более коротком фрагменте ДНК Х-хромосомы, содержащем 12 генов, такая же (Malezka et al., 1998). С другой стороны, при исследовании структуры протяженного района комплекса генов Bithorax, регулирующих становление плана (сегментов) тела насекомого, было показано, что значительную часть комплекса составляют межген-ные участки ДНК (Levis et al., 1995), выполняющие до конца не выясненные функции. Однако в геноме дрозофилы известно всего несколько районов, организованных подобно комплексу генов Bithorax, и, скорее всего, большинство генов эухроматической части генома дрозофилы находится в районах с компактной организацией транскрипции, похожих на район 2DF Х-хромосомы.
