Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
Возможность передачи генетической информации от клетки к клетке открыла новые пути к исследованию многих важнейших фундаментальных и прикладных проблем генетики, таких как взаимодействие ядра и цитоплазмы, межгенной и межаллельной комплементации, картирование генов, генетических механизмов канцерогенеза, регуляции действия генов и диффе-ренцировки и многих других проблем. Если в первых работах по гибридизации, гибридные клетки возникали спонтанно и были идентифицированы по наличию хромосомных наборов двух родительских линий, которые отличались по своему кариотипу, то в дальнейшем стали использовать мутантные линии клеток и селективные среды, позволяющие не только идентифицировать, но и изолировать гибридные клетки. Впервые такой способ был применен Литтлфилдом (Littlefield, 1964) при гибридизации двух линий мышиных клеток, одна из которых была дефектна по ГФРТ, а другая - по ТК. На среде HAT могли выжить только клетки, с нормальной активностью ГФРТ и ТК, т.е. гибриды, в которые эти ферменты были привнесены одной
252
и другой родительскими линиями. Поскольку спонтанное слияние клеток явление достаточно редкое, были предложены методы, ускоряющие этот процесс. На первом этапе в качестве сливающего агента использовали вирус Сендай, способный образовывать многоядерные клетки (Harris, Watkins, 1965; Harris et al., 1969; Klein et al., 1971), а позднее полиэтиленгликоль (ПЭГ) (Pontecorvo, 1975; Шей, 1985). Характерной особенностью клеток млекопитающих in vitro является их высокая совместимость. Гетерокарионы и даже гибридные линии могут образовываться в результате слияния клеток, принадлежащих не только разным видам, но даже более отдаленным систематическим единицам. Так, получены гибриды между куриными эритроцитами и клетками печени крысы, т.е. между клетками, принадлежащими к разным классам животных (Trisler, Coon, 1973).
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЯДРА И ЦИТОПЛАЗМЫ
Большой интерес представляют работы Харриса (1973), в которых изучались ядерно-цитоплазматические отношения. С помощью включения 3Н-уридина и 3Н-тимидина исследовали синтез нуклеиновых кислот при разных сочетаниях клеток, синтезирующих РНК, но не синтезирующих ДНК (макрофаги кролика, лимфоциты крыс) и клетками, не синтезирующими ни РНК, ни ДНК (эритроциты кур), а также с клетками линии HeLa, синтезирующими обе нуклеиновые кислоты. Как было показано, в гетерокарионах, в которых одна из родительских клеток не синтезирует РНК или ДНК, в то время как вторая их синтезирует, в ядре инертной клетки синтез соответствующей нуклеиновой кислоты восстанавливается. Даже в гетерокарионах между клетками HeLa и высокодифференцированными эритроцитами курицы в ядре эритроцита наблюдается синтез ДНК и РНК. Инертная клетка никогда не подавляет синтеза у активного партнера. Эти данные представляют исключительный интерес, так как демонстрируют возможность обратимости дифференцировки клеток с высоким ее уровнем, что в последнее время было подтверждено при получении клонов животных с использованием дифференцированных клеток взрослого организма.
АНАЛИЗ КОМПЛЕМЕНТАЦИИ
Возможность гибридизации соматических клеток позволяет исследовать межгенную и внутригенную (межаллельную) комплементацию. Выживание гибридов на селективной среде при попарной гибридизации мутантов с одинаковым фенотипом, будет свидетельствовать о наличии комплементации. Очевидно, в таком случае одинаковый фенотип контролируется разными генами, ответственными за разные звенья биосинтеза, определяющего данный фенотип. Отсутствие комплементации будет наблюдаться в том случае, если изучаемый фенотип зависит от действия одного и того же гена. Впервые комплементационный анализ был проведен на мутантах, ауксотрофных по глицину, а позднее на ауксотрофах по пуринам в клетках китайского хомячка СНО-К1, у которых было выявлено 9 групп комплементации (Puck, Као, 1982). Межаллельная комплементация по гену ГФРТ была детально изучена в Лаборатории генетики соматических клеток Института молеку-
253
лярной генетики РАН и установлено 9 групп комплементации (Волкова и др., 1981). Была исследована комплементация между 59 мутантами по ГФРТ, полученными на селективных средах с 8-АГ, 6-МП и 6-ТГ. Среди них были спонтанные мутанты и мутанты, индуцированные различными мутагенами. Было выявлено 9 комплементирующих пар мутантов, причем комплементация наблюдалась только между мутантами, выделенными в присутствии разных пуриновых аналогов. По-видимому, изученные мутанты представляют собой серию множественных аллелей.
ГЕНЕТИКА СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК
И КАРТИРОВАНИЕ ГЕНОВ
О значении картирования генов человека говорит создание международной программы “ Геном человека”, которая ставила своей задачей картировать все гены человека и секвенировать всю ДНК генома. Методы генетики соматических клеток открыли совершенно новые перспективы картирования генов. Эти методы позволили не только точно локализовать ген в определенной хромосоме и даже в определенном ее участке, но значительно ускорили процедуру картирования. Особое значение это имеет для картирования генов человека, которому уделяется наибольшее внимание, особенно для картирования генов, определяющих различные наследственные болезни. Ранее для локализации генов человека использовали анализ родословных. При таком методе удавалось картировать только гены, локализованные в Х-хромосоме, или в аутосомах в тех случаях, когда экспрессия гена была всегда связана с наличием определенных специфических хромосомных аберраций. Поэтому до разработки методов генетики соматических клеток у человека были картированы преимущественно гены, локализованные в Х-хромосоме, в частности впервые Вильсоном был картирован на этой хромосоме ген дальтонизма (Wilson, 1911)-
