Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
Генетика соматических клеток позволила перевести исследования спонтанного мутагенеза с хромосомного на генный уровень в прямом эксперименте. Такие эксперименты чрезвычайно важны, учитывая роль генных мутаций как основы новых адаптивных признаков в эволюции вида, а также их значение в селекционной работе. Было установлено, что частота генных мутаций одинакова в соматических и герминальных клетках в расчете на кле-
250
точную генерацию, но значительно выше в расчете на единицу времени. Такое явление вполне объяснимо, если учесть, что многие мутации являются вредными. Следовательно, мутация в герминальной клетке будет снижать жизнеспособность организма и, как следствие, приносить вред популяции в целом, в то время как мутация в соматической клетке будет вредна лишь для отдельных клеток (Шапиро, Варшавер, 1976).
Для дальнейшего успешного развития генетики соматических клеток необходимо было создать коллекцию мутантов. Поскольку спонтанный темп мутирования в соматических клетках достаточно низок, важно было разработать методы индукции мутаций и тем самым ускорить мутационный процесс. Для мутантов соматических клеток характерны изменения определенных ферментов, контролирующих такие признаки, как пищевые потребности, резистентность к различным токсическим химическим веществам, тем-пературочувствительность и другие подобные признаки. Идентификация и выделение таких мутантов возможны лишь путем создания селективных условий, при которых основная масса клеточной популяции погибает, а выживают только мутантные формы. На первом этапе при попытке индукции мутаций в соматических клетках возник ряд методических трудностей, которые, однако, были успешно преодолены, и в 1968 г. индукция генных мутаций в соматических клетках была одновременно и независимо достигнута в трех лабораториях (Шапиро и др., 1968; Chu, Mailing, 1968; Као, Puck, 1968). Мутанты, резистентные к различным токсическим веществам, выделяются с использованием селективной среды, содержащей определенное вещество в концентрации, летальной для исходной популяции. Наибольшее распространение получили мутанты, резистентные к аналогам пуриновых оснований. Биохимический анализ показал, что этот тип резистентности определяется изменением или полным отсутствием фермента гипоксантинфосфорибозил-трансферазы (ГФРТ"). Такая мутация присутствует у больных с синдромом Lesh-Nyhan. Ген, кодирующий ГФРТ, локализован в Х-хромосоме. Разработана специальная селективная среда, содержащая гипоксантин, аминопте-рин и тимидин (HAT), позволяющая улавливать обратные мутации к норме (Szybalska, Szybalski, 1962; Littlefield, 1964).
Мутантные клетки грызунов и человека резистентные к аналогам пуриновых оснований были получены и используются во многих лабораториях мира (Шей, 1985; Shapiro, Varshaver, 1975). В Лаборатории генетики соматических клеток ИАЭ были выделены мутанты клеток человека и китайского хомячка резистентные к 8-АГ, 6-МП и 6-ТГ (Маршак, Варшавер, 1970; Волкова и др., 1981). Были получены также мутанты, резистентные к аналогам пиримидинов с мутацией тимидинкиназы (ТК) (Patterson, Camright, 1977), к оубаину (Чеснокова, Мануйлова, 1991) и ряду других веществ (Шей. 1985). Создание селективных условий для выделения ауксотрофных мутантов значительно сложнее, чем для выделения резистентных форм. В генетике соматических клеток наиболее распространен метод, в основе которого лежит создание условий для гибели размножающихся клеток дикого типа и выживания мутантов. Для этого используют явление повышения чувствительности клеток, включивших в ДНК вместо тимина его галоидозамещенные аналоги, к различным видам излучений. В Лаборатории генетики соматических клеток ИАЭ в среду, минимальную по определенному веществу, добавляли 5-бромдезоксиуридин (БДУ). Размножающиеся прототрофные
251
клетки дикого типа включали БДУ при синтезе ДНК, что приводило к их гибели при последующем облучении длинноволновым УФ. Ауксотрсфы, сохранявшие в течение 2-3 сут. культивирования жизнеспособность, но не размножавшиеся при этом, а следовательно, не включавшие БДУ, выживали после облучения. Наибольшее число ауксотрофных мутантов было получено в линии клеток китайского хомячка СНО (Puck, Као, 1982). В Лаборатории генетики соматических клеток ИАЭ были получены линии клеток китайского хомячка, ауксотрофные по глутамину (Varshaver et al., 1977), а также температурочувствительные мутанты (Варшавер и др., 1972). Были также выделены два клона клеток китайского хомячка, чувствительные как к летальному, так и к мутагенному действию УФ-излучения. Было установлено, что радиочувствительность определяется нарушением пострепликатив-ной репарации (Мануйлова, Шапиро, 1973; Пинто и др., 1980).
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ В СОМАТИЧЕСКИХ
КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ И СФЕРЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ
Для соматических клеток уже в 60-х гг., т.е. в самом начальном периоде развития генетики соматических клеток, для проведения генетического анализа, был предложен своеобразный метод парасексуальнсго процесса (Barski et al., 1960, 1961). Оказалось, что при совместном культивировании клетки разных линий способны сливаться, образуя двуядерные и многоядерные гетерокарионы. В конечном счете возникают две одноядерные дочерние клетки, содержащие хромосомы, полученные от исходных родительских клеток, которые во многих случаях могут дать начало длительно размножающимся гибридным клеточным линиям. Такие гибриды могут содержать полный набор хромосом одной из исходных клеток и одну или несколько хромосом из другой. Такие гибридные клетки служат мощным орудием исследования функций индивидуальных хромосом. Методы гибридизации получили широкое распространение и стали совершенствсваться во всех лабораториях, изучающих генетику соматических клеток. В Советском Союзе гибридизация соматических клеток впервые была осуществлена в Лаборатории соматических клеток ИАЭ (Волкова, Какпакова, 1972).
