Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
У высших эукариот взаимосвязь регуляции транскрипции и репликации сложнее и ее анализ находится в настоящее время на стадии становления. Такое положение сложилось из-за того, что сами ori значительно больше по размеру и более сложно устроены (см. обзор: De Pamphilis, 1993). Важной особенностью ori высших эукариот, также усложняющей их анализ, является то, что большинство известных ori локализованы в регуляторных районах генов (De Pamphilis, 1999). Присутствие сайтов связывания с различными транскрипционными факторами является неотъемлемой характеристикой этих районов. Однако функциональная значимость присутствия этих сайтов в ог/'-содержащих районах генома в настоящее время мало изучена. На данном этапе большое значение приобретают модельные исследования, в ходе которых функционирование различных генетических элементов и их комбинаций исследуется на автономных (эписомных) рекомбинантных конструкциях (см. обзор: Murakami, Ito, 1999).
Новыми являются данные о том, что репликация ДНК может сильно менять функциональное значение генетических контекстов (см. обзор:
240
Murakami, Ito, 1999). Так, например, было показано, что репликация ДНК способна подавить негативную функцию сайленсеров, репрессирующих транскрипцию нескольких групп генов (Yamaguchi, Matsukage, 1990). Этот эффект достаточно сложен. Действительно, было обнаружено, что в том случае, когда транскрипция управляется с проксимального промотера (лишенного энхансера транскрипции), положительный эффект процесса репликации на транскрипцию не обнаруживается; для его проявления в каждом конкретном случае требуется наличие синергических отношений между cri/ARS-элементом и энхансером транскрипции (Wilson, Patient, 1993).
Суммируя вышеприведенные данные и наблюдения, которые в настоящее время носят разрозненный характер, можно признать сложный характер взаиморегуляции репликации и транскрипции. Очевидным является тот факт, что стимулирующее действие некоторых транскрипционных факторов может увеличивать частоту инициации репликации в определенных участках хромосом. Элементы, усиливающие репликацию, - энхансеры репликации, такие как октамерные мотивы и другие элементы - могут, по-види-мому, играть важную роль в регуляции репликации генома и клеточного цикла у высших эукариот.
Несомненно, эти элементы также могут быть с успехом использованы для конструирования нового поколения невирусных автономно-реплициру-ющихся плазмид.
По нашим представлениям, одним из возможных подходов к решению этого вопроса может быть частичная имитация генетических контекстов тех участков генома, которые управляют как репликацией, так и транскрипцией. Действительно, именно в таких участках локализовано около половины всех картированных on генома высших эукариот (De Pamphilis, 1999). Исходя из этих данных, можно предполагать, что возможным вариантом дизайна автономного экспрессирующего вектора является клонирование on/ARS-элемента непосредственно перед или близко к промотору целового гена (например перед CMV-промотором широко распространенных плазмид pCI-neo (“Promega”) и pcDNA3, pcDNA4 (“Invitrogen”). Такой принцип дизайна рекомбинантной конструкции является естественной имитацией природных генетических контекстов.
Помимо этого принципиального шага потребуется также доводка конструкции вектора, необходимая для обеспечения заданного соотношения между уровнями копийности самого вектора, а ггакже РНК-продукта. Решение вопроса о соотношении копийностей может быть существенным моментом в выборе схемы генно-терапевтического курса. Очевидно, сопряжения репликации и транскрипции будет являться важным моментом для создания перспективных невирусных автономных векторов.
О НОВЫХ МЕТОДИЧЕСКИХ ВОЗМОЖНОСТЯХ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ В XXI в.
Задачей генной терапии является достижение в клетках-мишенях физиологически активных уровней терапевтического продукта. Кроме того, в большинстве случаев требуется пролонгированное поддержание этого уровня для достижения терапевтического эффекта. При этом особым требова-
241
нием, предъявляемым к генно-терапевтическому средству, является его безопасность для генетического аппарата клетки. Этим требованиям медицины в полной мере удовлетворяют только автономные (экстрахромосомные) векторы, функционирующие на основе невирусных элементов, пролонгирование экспрессирующие терапевтические продукты (за счет поддержания собственной копийности в клетках-мишенях). Векторы этого типа должны открыть новый этап в развитии генной терапии и преодолеть недостатки предыдущего поколения векторов, основанных на использовании рекомбинантных вирусов и простых (нерепликативных) плазмидных конструкций (Calos, 1996).
Для создания векторов нового типа требуются компактные невирусные ARS-последовательности с изученной модульной структурой и понимание взаимосвязи процессов автономной репликации и транскрипции в экстрахромосомных трансгенах.
За счет использования компактных невирусных ARS-элементов (составляющих не десятки, а несколько тысяч п. н.) представляется возможным создание безопасных челночных векторных конструкций, которые можно получать в препаративных количествах в Е. coli и которые способны нести достаточно протяженные целевые последовательности ДНК, кодирующие генно-терапевтический продукт или несколько таких продуктов.
