Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
238
Мы также считаем, что использование процесса “адаптации” экзогенной ДНК in vivo как одного из этапов конструирования автономных векторов, может дать принципиально новые возможности по созданию стабильных конструкций, способных к длительному персистьрованию и экспрессии целевых последовательностей как в трансгенных организмах, так и в специализированных клетках высших эукариот.
СОПРЯЖЕНИЕ ПРОЦЕССОВ РЕПЛИКАЦИИ И ТРАНСКРИПЦИИ -
НОВЫЙ ПРИНЦИП КОНСТРУИРОВАНИЯ АВТОНОМНЫХ ВЕКТОРОВ
Одним из результатов тестирования ARS-активности дериватов рг8а в трансформированных дрожжах является установление совместимости процессов автономной репликации и транскрипции гена селективного маркера автономных трансгенов, сконструированных на базе этой плазмиды. Ранее такие же данные были получены для невирусного автономного трансгена клеток человека pNeo.Myc-2.4. В обоих случаях рассматриваемые конструкции представляют собой класс стабильных автономных трансгенов, которые являются прототипами перспективных конструкций для широкого спектра задач генной терапии.
Важно, что сопряжение процессов автономной репликации и транскрипции не следует автоматически из самого наличия некоторого набора регуляторных элементов, а подразумевает существование “разрешенных” и “запрещенных” комбинаций этих элементов. Неучет взаимовлияния репликации и транскрипции может приводить к подавлению того или иного процесса (Waldensrrom et al., 1992) или обоих одновременно (Chen et al., 2000).
Уже давно признается очевидным, что репликация ДНК и транскрипция во многом сходны. Действительно, оба эти процесса требуют узнавания специфических последовательностей (участков инициации репликации или промоторов транскрипции) и включают в себя стадию сборки мультибелко-вых комплексов, способных к локальному расплетанию ДНК и инициации (с последующей элонгацией) процессов матрица-зависимого синтеза поли-нуклеотидь ых цепей.
Первые намеки на взаимозависимость репликации и транскрипции появились в 80-е годы, когда стали накапливаться сведения о том что репликация ДНК может быть связана с такой формой репрессии транскрипции, как сайленсинг. Данные, полученные в первой половине 90-х годов на модели дрожжей, непосредственно показывали, что комплекс белковых молекул, узнающий ориджины репликации дрожжей и специфически связывающийся с ними (ORC-комплекс), играет ключевую роль как в репликации ДНК, так и в сайленсинге. Детальный молекулярно-генетический анализ сайленсе-ров дрожжей (таких как Е- и I-элементы локусов HML и HMR ) позволил выявить их тонкую структуру. В частности было показано, что HMR-Е сайлен-сер состоит из трех генетических элементов: А, Е и В (Brand et al., 1987), вносящих различный вклад в подавление транскрипции. Было обнаружено, что A-элемент сайленсера содержит ACS-последовательность, с которой способен связываться ORC. Е- и В-элементы сайленсеров несут сайты связывания транскрипционных факторов RAP1 и ABF-1 (Bell et al., 1993). Анализ свойств синтетических сайленсеров, моделирующих Е- и I-элементы, пока-
239
зал, что для проявления их свойств достаточно этих трех сайтов связывания. Свойства сайленсера таковы, что элементы, играющие независимую роль в активации как процессов репликации так и транскрипции, функционируя в новом контексте совместно, каким-то, пока не ясным образом, подавляю! транскрипцию. При этом сайленсеры дрожжей проявляют собственную ARS-активность (см. обзоры: Laurenson, Rine, 1992; Kelly et al., 1994).
Одним из достижений последнего десятилетия в области понимания механизмов репликации и транскрипции было открытие важной роли некоторых транскрипционных факторов в регуляции репликации. Наиболее убедительные данные о характере участия транскрипционных факторов в репликации были получены при детальном изучении жизненного цикла ряда вирусов в эукариотических клетках и при функционально-делецион-ном анализе ori и фланкирующих их последовательностей в дрожжах S. cerevisiae.
Так, например, изучение репликации аденовируса - первого вируса, для которого была создана модельная система репликации in vitro - показало, что такие транскрипционные факторы, как NFI и NF III (Oct-1), независимо друг от друга стимулируют вирусную репликацию (в 60 и 6 раз, соответственно). Их одновременное присутствие в тест-системе in vitro приводит к 200-кратно-му росту скорости репликации (Coenjaerts et al., 1994; Mul et al.,1992).
В дрожжах S. cerevisiae структура области on напоминает таковую у вирусов животных и состоит из основной области (где находится консенсусная ARS-последовательность) и прилегающих к ней участков ДНК (Ь-области). Известно, что хорошо изученный ВЗ-элемент ARS1 содержит сайт связывания с транскрипционным фактором Abfl. Связывание этого фактора со своим сайтом увеличивает репликационную активность ARS1 (Marahrens, Stillman, 1992). При этом ВЗ-элемент в ARS1 может быть заменен на сайт связывания с транскрипционным фактором GAL4 без существенной потери функциональной активности этого ori (Murakami, Ito, 1999). Новейшие данные по исследованию модулирующего действия этих транскрипционных факторов на ARS1 активность показали, что конечный эффект от действия этих факторов на репликационную активность зависит от генетических контекстов достаточно обширных прилегающих областей (Kohzaki et al., 1999).
