Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
В ходе детального изучения судьбы рг8а после ее переноса в пронуклеус мышей (Николаев и др., 1998) нами было показано, что в трансгенных мышах последовательности ДНК, гомологичные рг8а, имеют автономный статус, что проявлялось прежде всего в неменделевском характере наследования трансгена. Высокая частота передачи автономного трансгена ртус(Н-Р) по наследству была ранее описана также на модели трансгенной мыши, для которой была определена 100%-ная передача трансгена по наследству по материнской линии (рис. 79) (Sudo et al., 1990). В нашем исследовании было обнаружено, что при переносе, а также при передаче по наследству, в трансгенах происходили последовательные делеции ДНК рг8а. Такой процесс продолжался вплоть до F2 поколения трансгенных животных, в котором была обнаружена стабилизация структуры трансгена (рис. 85, 86). Ранее элиминация более чем половины массы переносимой ДНК, сопровождаемая формированием миниплазмиды, была обнаружена в ходе изучения поддержания в клетках HeLa автономного трансгена pNeo.Myc-2.4, содержащего ARS-фрагмент ori гена с-тус. Миниплазмида стабильно поддерживалась в клетках HeLa наряду с исходным конструктом, а также с высокомолекулярными олигомерными формами (McWhinney, Leffak, 1990). Следует отметить, что олигомерные формы дериватов рг8а были обнаружены нами совместно с мономерными формами трансгенов в ходе исследования судьбы рг8а в трансгенных мышах (см. рис. 85).
Сопоставление результатов работ, проведенных на трансформированных дрожжах и трансгенных мышах, позволяет предположить, что центральный фрагмент размером 2,4 т. п. н. является одним из модулей ARS рг8а, обеспечивающим автономный статус трансгена в дрожжах и, вероятно, вносящий вклад в автономное поддержание дериватов рг8а в трансгенных мышах, хотя для последней хозяйской системы мы еще не можем оценить роль 0,95 т. п. н. фрагмента. Для дальнейшей характеристики межмодульных взаимодействий в ARS рг8а нами проводится эксперимент по определению статуса модельного конструкта, несущего 2, 4 т. п. н. фрагмент в трансгенных мышах. Мы полагаем, что фрагмент 2,4 т. п. н. может представлять собой минимизированный ARS рг8а, который способен поддерживать автономный
237
статус трансгенов не только в трансформированных дрожжах, но и в других гетерологических системах. Миниминизированные ARS-элементы (размером менее 1 т. п. н.) были ранее изолированы из состава ori гена с-тус человека ( McWhinney, Leffak, 1990; Waltz et al., L996).
Совокупность наших данных позволяет заключить, что ARS рг8а имеет размер приблизительно 3 т.п.н. и включает центральный и, возможно, один из фланкирующих фрагментов оригинальной шелкопрядной последовательности рг8а, составляя, таким образом, 80% ее массы. Для сравнения можно отметить, что ori гена альдолазы В имеет размер 1-2 т. п. н. (Zhao et al., 1997), ori\3 локуса DHFR имеет размер около 4 т. п. н. (Dijkwel, Hamlin, 1992; Caddie, Calos, 1992), or//ARS-3neMeHT гена с-тус - 2,4 т. п. н. (Leffak, James, 1989; McWhinney, Leffak, 1990).
Важной особенностью процесса перестроек переносимых конструктов в использованных нами трансге гных объектах является их неслучайный характер. Последовательности RSV (включая LTR) подверглись полной элиминации в трансгенных шелкопрядах (Николаев и др. 1991, 1992, 1993; Чкония и др., 1991). В трансгенных мышах, с использованием механизма последовательных делеций, были полностью элиминированы бактериальные последовательности и фрагмент шелкопрядной последовательности рг8а (рис. 85). В ходе последнего процесса перестройки трансгенов были однотипны в различных сибсах одного и того же поколения, в чем заключалось отличие от наблюдений, полученных на трансгенных шелкопрядах. Это может означать наличие различий в рекомбинационных системах клеток полового пути насекомых и млекопитающих. При этом важно отметить, что стабилизация автономных трансгенов шелкопряда и мыши произошла одновременно - в Р2-поколении трансгенных особей (см. рис. 83-85).
Неслучайный характер перестроек автономных трансгенов также очевиден на модели трансгенов, поддерживаемых в трансформированных клетках дрожжей. Действительно, изменения в структуре переносимого конструкта (появление “дополнительной” ДНК) было обнаружено только в случае (+) ориентации ДНК рг8а в векторе р(27-8) (рис. 86) Спасение плазмид, проведенное для соответствующих трансгенов, выявило идентичность перестроек векторной ДНК для всех исследованных случаев. Можно предполагать, что неслучайный характер перестроек, наблюдаемых на различных трансгенных моделях, отражает общие принципы специфического взаимодействия между экзогенной экстрахромосомной ДНК и хозяйским геномом. В пользу этого предположения свидетельствуют также и данные по стабильному поддержанию делетированного варианта известного трансгена pNeo.Myc-2.4 (миниплазмиды) во множестве клеточных линий HeLa (McWhinney, Leffak, L990).
Согласно нашей гипотезе, функционирование хозяйской рекомбинационной системы в некоторых организмах (шелкопряд, мышь и других) может быть направлено на перестройку разнообразных форм перенесенной ДНК в пользу формирования трансгенов, способных к автономной репликации. Мы считаем, что в таких хозяйских системах экзогенная ДНК претерпевает серию неслучайных перестроек, приводящих в конечном итоге к “адаптации” трансгена к стабильному экстрахромосомному поддержанию. По-видимому, “адаптация” связана с негомологичной рекомбинацией, происходящей между автономными трансгенами и хозяйским геномом.
