Молекулярная биология. Структура и функция белков - Степанов В.М.
ISBN 5-06-002573-Х
Скачать (прямая ссылка):
При сближении с гликозидной связью субстрата в фермент-суб-стратном комплексе эта группа выступает как донор протона, присоединяющегося к гликозидному атому кислорода с образованием неустойчивого положительно заряженного оксониееою иона:
Гликозидный
кислород
ь
“0“Н ...о
I
Карбоксил Glu-35
0
L /
“С-5...В-0 <
I
Оксоииевый
ион
• С .
Далее оксониевый ион стабилизируется за счет перемещения* к атому кислорода электронной лары, обслуживавшей его связь с С-1-атомом звена D. Следует разрыв- связи между этими атомами и вместе с тем между звеньями D и Е, причем положительный заряд переносится на атом С-1 с образованием карбониевою иона. Дисахарид Е—F или
236
шк
о-м г/
-с;
0-И
Рис. 10.9. Механизм действия лизоцима
Протон карбоксильной группы Glu-35 переносится на сближенный с ним кислород гли-козидной связи, образуя оксониевый ион. Далее электронная пара, обслуживавшая связь атома С-1 NAG и этого атома кислорода, переносится на последний, что приводит к разрыву гликозидной связи. В ревультатв атом С-1 оказывается заряженный положительно, т.е. приобретает свойства карбокахиона, имеющего плоскую структуру, чему благоприятствует конформация палукресла. Дополнительно заряд стабилизируется взаимодействием с отрицательно заряженной карбоксилатной группой остатка Авр-62. На завершающей фазе реакции молекула воды занимает место ушедшего кислорода гликозидной связи, поляризуется за счет взаимодействия с анионной формой Glu-35 и образовавшийся гидроксил-ион атакует несущий положительный заряд атом С-I (остальные пояснения см. в тексте)
аналогичный фрагмент более длинного субстрата покидает после этого зону связывания субстрата, так как его соединяют с ней лишь немногие нековалентные взаимодействия, а связь с фрагментом А—В—С—D утрачена.
Остаток Glu-35 критически важен для каталитического механизма
— его замена на глутамин, проведенная методом сайт-специфичного мутагенеза, лишает фермент активности.
(Положительный заряд на С-1 стабилизируется двумях^акторами:
237
1. Устанавливается электростатическое взаимодействие между ним и отрицательно заряженным карбоксилат-анионом Asp-52, весьма эффективное в отсутствие воды, которая вытесняется с поверхности фермента при связывании субстрата. Заслуживает внимания то',’ что кислотные свойства карбоксильной группы этого остатка в отличие от карбоксила Glu-35 усилены его гидрофильным окружением Это объясняется тем, что анионная форма карбоксила Asp-52 стабилизируется путем включения в систему водородных связей с соседними остатками.
Следует обратить внимание на столь характерное для белков вообще изменение свойств функциональных групп за счет разницы в их микроокружении. Роль этой группы нельзя недооценить, но она, видимо, не абсолютно необходима — замена Asp-52 на аспарагин снижает удельную активность фермента примерно до 5% от исходной, но не приводит к полной его инактивации.
2. Положительный заряд на атоме С-1 частично компенсируется смещением электронной пары от соседнего с ним атома кислорода в цикле. При этом связь 0 — С+ приобретает характер частично двойной, что приводит к плоскостной конформации всего этого участка кольца D и переходу атома С-1 из обычной тетраэдрической в тригональную структуру:
Но как раз такая конформация, необходимая для стабилизации карбокатиона, соответствует структуре полукресла и реализуется © фермент-субстратном комплексе за счет отмеченного выше искажения стереохимии кольца D при связывании олигосахарида. По-видимому, необходимая для этого энергия "заимствуется" из энергии связывания протяженного субстрата.
Таким образом, электростатические и стереохимические эффекты в каталитическом центре лизоцима действуют согласованно, стабилизируя структуру плоского карбокатиона, характерную для переходного состояния в фермент-субстратном комплексе. ,
Далее карбокатион подвергается атаке молекулой воды, которая связывается анионом остатка Glu-35, занимая примерно то же место; в котором находился кислород гликозидной связи перед -лее расщеплением.„
Анион Glu-35 поляризует молекулу воды,- отрывая протощ лтр соответствует свойствам карбоксильной группы этого остатка как
238
слабой кислоты. Образующийся сильный нуклеофил — ОН'нион — атакует положительно заряженный атом углерода С-1 с одновременной нейтрализацией зарядов. Поскольку молекула воды приближается к плоскому карбокатиону с той же стороны, где находился кислород гликозидной связи, стереохимия атома С-1 полностью восстанавливается и гидроксильная группа при этом атоме занимает, подобно кислороду гликозидной связи, /9-положение:
