Молекулярная биология. Структура и функция белков - Степанов В.М.
ISBN 5-06-002573-Х
Скачать (прямая ссылка):
9.3.2. Аффинные реагагёы ¦
’ | * •#'•»’ * '* A i.1
Как бы ни был построен реагент, используемый при химической модификации,- его взаимодействие с той или иной функциональной группой всегда начинается с того; что он связывается в ее1 окрестности/ Таким образом, специфичность, ИЭбирательность реакции определяется не только химическими особенностями, внутренне' Присущими данной функциональной группе в белковой структуре, но и наличием вблизи нее- благоприятных (или/- наоборот, неблагоприятных) условий для связывания модифицирующего реагента. Для изучения функциональных трупп в активном центре "белка выгодно использовать такие соединения, в которых собственно химически активная! группа присоединена к структуре, "узнающей" активный центр, точнее ту его часть, которая ответственна ва связывание специфического лйп&Да (например, субстрата или эффектора). Такие адресованные реагенты с большой вероятностью сорбируются в активном центре и затем образуют ковалентную связь с теми или иными функциональными группами, локализованными в нем. Протеканию реакции благоприятствует сближение химически активной группы реагента и модифицируемого ами-
199
нокислотного остатка, поэтому собственная реакционная, сдособность первой может и не быть высокой. ...
Р качестве примера можно указать на целый ряд пептидилбром-метилкетонов, построенных следующим образом:
Пептидная (адресующая) часть. такой молекулы. специфически присоединяется к протеиназе за счет, образования систему водородных связей между пептидными группировками аналога субстрата и фермента, а также взаимодействия боковых радикалов &i, и с зоной связывания. В результате реакционноспособная группировка СОСНгВг оказывается пространственно сближенной с активным центром. В сериновых протеиназах она избирательно реагирует с имидазольной группой гистидина, принадлежащего активному центру:
Важной областью применения химической модификации является соединение, "сшивка" белковой* молекулы с другими молекулами, сближенными с ней в биологических структурах. Это открывает возможность изучения геометрии подчас весьма сложных межмолекуляр-ных комплексов. Так, бифункциональный реагент, диметил-3,3'-ди-тиоби с-п р оп иоимидат
О
RCO-^H-CHRa-CO-NH-CHEa-CO-NH-CJffii-C-CHzBr
4------- -—.---г --------—---------*¦ 4----Ь _
"Адресующая" часть реагента
Активная группа г
- НС~"— с-он2
Остаток
гистидина
Остаток реагента
*»
9.3.3. Химическое м»ди^||*рровмтр в изучении i межмолекулярных ашкплексо» и синтезе конъюгатов белков
NH
II
II '
СН30-С—CH2€H2-S-S-CH2Cli2-C—ОСНз
200
способен модифицировать, подобно монофункциональному имидоэфи-ру, е-амийогруппы Лизина, отстоящие друг от друга примерно на 12 А. Это позволяет "сшивать" соседние белки в субъединице рибосом, F-актин и фрагмент миозина, белки в мембранах эритроцитов и т.д. Существенно, что "сшивка41 содержит в этом случае дисульфидную связь, которая может быть в дальнейшем расщеплена мягким восстановлением. Это приводит к разделению белков, образовавших конъюгат, и облегчает их идентификацию. Образуемые при помощи таких же или аналогичных реагентов внутримолекулярные сшивки иногда используют для оценки расстояний между функциональными’группами на поверхности белковой глобулы.
Разумеется, бифункциональные сшивающие реагенты могут содержать и неодинаковые реакционноспособные группы. Это особенно удобно при получений конъюгатов; объединяющих белки с разными функциональными свойствами, например иммуноглобулины и ферменты (обычно пероксидазу или фосфатазу), что необходимо для иммуно-ферментного анализа: Одним из таких реагентов является N-оксисук-цинильны# эфир m-малеимидобензойиой кислоты: • ”
СН2—(Г ¦ О 11 сн=сн
I Ч II Х'' ‘ \ 1 *г
Vfl-c-(k >еи
¦ гГ п ^^С0~СН N-Замещенный малеимид;
1И2 I
; IN | реагирует с т^оловыми
А ¦*'^ч€0*-СН груййами ,l- Г
Л^-Оксисукцинимид-ный эфир; реагирует с аминогруппами
Его малеимидная группа способна присоединять сульфгидрильные группы цистеина, -а'’ ГСкжсисук^#гаильный эфир ацилирует е-аминогруп-пы остатков лизина. Поскольку ^яти реакции протекают в различных условиях, можно избежать образования случайных пар белков.
Получили распространение модифицирующие реагенты, содержащие фото Активируемую фешлазидпую группировку. При освещении замещенных фенилазидов УФ-светом с длиной волны 265—275 нм, эти, в обычных условиях вполне устойчивые, ^вещества распадаются, с.обра-
