Молекулярная биология. Структура и функция белков - Степанов В.М.
ISBN 5-06-002573-Х
Скачать (прямая ссылка):
Понятно, что при ренатурации белка in vitro оба указанных фак-' тора работать не могут и она (хотя и в этом случае протекает не случайным образом, а по ограниченному числу путей) требует для поиска этих путей гораздо более значительного времени, чем in vivo.
Существование определенною пути свертывания полипептидной цепи, считавшееся до недавнего времени весьма вероятной гипотезой, поддерживает ряд экспериментальных фактов. Так, дисульфидные связи в панкреатическом ингибиторе трипсина и рибонуклеазе замыкаются в определенном порядке, причем не обязательно сразу происходит образование "правильных" связей, т.е. тех, которые существуют в конечной форме — нативном белке. Иногда наблюдается временное образование дисульфидной связи между остатками цистеина, которые, видимо, сближаются в промежуточном соединении. Впоследствии такая дисульфидная связь вступает в реакцию обмена с другими, еще не окисленными остатками цистеина и расщепляется, уступая место связям, характерным для нативной конформации.
Применение метода направленного мутагенеза (белковой инженерии) показало, что наряду с аминокислотным^ остатками, критически
134
важнйми для формирования устойчивой пространственной структуры белка, встречаются и такие, замена которых иными не сказывается на стабильности белковой глобулы, но серьезно влияет на кинетику свертывания полипептидной цепи. Следовательно, эти аминокислотные остатки Важны для возникновения промежуточных структур на пути к нативной, устойчивой глобуле.
Так, при свертывании о-субъединицы трипто-фансинтетазы (рис. 6.11) наблюдается промежуточная ступень, на которой крупный N-концевой
домен (содержащий аминокислотные остатки 1—
188 и образованный шестью отрезками параллельной /Структуры и пятью о-спиралями) уже свернут, тогда как С-концевой фрагмент (начинающийся со 189-го остатка и формирующий в нативном белке два отрезка /2-структуры и три о-спирали; всего 80 аминокислотных остатков) еще денатурирован, неупорядочен. Заметим, что'в этом белке нет пространственно отграниченных дрменов — его структура достаточно компактна, речь идет о доменах как промежуточных формах свертывания о-субъединицы.
Среди мутантов этого фермента были отобраны такие, которые* затрагивают контакты между N- и С-концевым доменами. Phe-22 N-концевого домена, контактирующий с 8-м /^-структурным отрезком в С-коццевом домене, был заменен на Leu. При этом замедлились скорости денатурации и ренатурации, но не была затронута стабильность белка.
I
Очевидно, что это обусловлено понижением стабильности переходного состояния при свертывании. Замена Gly-234 в С-концевом домене на аспарагиновую кислоту замедлила развертывание в большей мере, чем свертывание. Поскольку первый и восьмой /^-структурные отрезки, в которые включены соответственно фенилаланин и глицин,
135
Рис. 6.11. Третичная структура о-субъединицы триптофансинтетазы •
Образована, как и триозофосфаТизомераза, чередующимися о-спиралями (цилиндры) и отрезками fi-структуры (стрелки). Маленькими кружками в центре показано место связывания ингибитора. Стрелкой обозначена граница между N- и С-концевыми доменами, в атом районе по остатку Arg-188 происходит гидролиз трипсином, который приводит к разделению доменов. Номера указывают порядок расположения элементов вторичной структуры
сближены в третичной структуре свернутой субъединицы их взаимное "причаливание" играет, по-видимому, важную роль в формировании промежуточного продукта свертывания,' ускоряя процесс рена-турации. v
Исследование кинетики ренатурации ряда белков позволяет в первом приближении так описать этот процесс. Сначала быстро образуются короткие отрезки вторичной структуры — отпирали, Д-листы, /^-изгибы. Понятно, что каждый такой участок сам по себе до образования компактной глобулы, недостаточно стабилен, поэтому соответствующие элементы вторичной структуры то. возникают то распадаются, "мерцают" (рис. 6.12).
Рис. 6.12. Конформационные состояния фрагмента ,69-87, соответствующего С-крнцевой а-спирали миогемэритрина (по данным ЯМР):
а - набор неустойчивых конформаций, которые пептид принимает в воде; 6 - преимущественная. конформация пептида в менее полярной среде (смесь вода - три-фторэтанол), при которой С-концевая часть образует O'-спираль; в — кбнформация пептида в компактной структуре миогемэритрина - о-спираль охватывает всю последовательность; цифрами обозначены номера остатков в пептиде а и б и соответствующем фрагменте миогемэритрина (в)
136
' Затем такие, участки относительно организованной структуры! составляющие в совокупности фрагмент полипептидной цепи иэ 50—150 аминокислот (будущий домен белка), как бы "охлопываются" за счет нековалентных взаимодействий. При этом образуется так называемая расплавленная глобула, которая в целом близка к нативной пространственной структуре и отличается от нее меньшей компактностью и < иным размещением боковых цепей аминокислотных остатков. Далее происходит уточнение структуры на уровне доменов, после чего устанавливается контакт между последними. Этими относительно медленно протекающими стадиями завершается формирование белковой глобулы, и она приобретает активность.
