Молекулярная биология. Структура и функция белков - Степанов В.М.
ISBN 5-06-002573-Х
Скачать (прямая ссылка):
агрегации — явления, резко ограничивающего возможности синтеза длинных пептидов в растворе.
Твердофазный синтез пептидов, который состоит из строго одинаковых повторяющихся стадий, удалось автоматизировать —*' были созданы автоматические синтезаторы пептидов.
На практике метод все же ограничен неполнотой присоединения ациламинокислоты в отдельных циклах. Понятно, что "недостроенный" в том или ином цикле пептид будет ацилирован в следующем, что приведет к пропуску аминокислотного остатка. Образование таких пептидов с ошибочными последовательностями даст при синтезе длинного пептида весьма сложную смесь продуктов. Метод оказался особенно продуктивным в сочетании с высокоэффективной жидкостной хроматографией, которая ч позволяет выделить главный ' компонент среди множества продуктов твердофазного синтеза.
Сочетание твердофазного синтеза и высокоэффективной жидкостной хроматографии в настоящее время — главный способ получения небольших количеств 15—20-членных пептидов, в частности пептидных детерминант, используемых для получения специфических антител к тому или иному белку.
Применение различных приемов пептидного синтеза,' по преимуществу твердофазного, позволило получить некоторые, как правило, не очень большие белки. Первоначально эти работы имели только принципиальный характер, демонстрируя возможность чисто химического синтеза белков. В последнее время, однако, проведены синтезы белков, имеющие практическое значение. В частности, в значительных количествах удается получать инсулин, ряд других пептидных гормб-1 нов, например кальцитонин рыб (32 аминокислотных остатка), синтезируемый партиями по 50 — 100 г, фактор роста эпителия (53 остатка), росттрансформирующий фактор а (50 остатков), интерлейкин-3 (140 остатков), а\- и аг-интерфероны лейкоцитов человека и их аналоги, панкреатический ингибитор трипсина. Синтезирована и использована для определения пространствённой структуры протеиназа вируса иммунодефицита человека, пептидная цепь которой содержит 99 аминокислот. Характерно, что свертывание полученных синтетически пептидных цепей в нативную структуру происходит самопроизвольно и не вызывает существенных затруднений.
Несмотря на То что получение белков в значительных количествах в ближайшем будущем будет, по-видимому, основано на микробиологическом синтезе или синтезе в бесклеточной системе, возможны и дальнейшие успехи в развитии химических способов получения крупных пептидов и белков. Определенные перспективы имеет и так называемый полусинтез белков, при котором полипептидную цепь белка 34
собирают из пептидных фрагментов, полученных ограниченным про-теолизом и чисто химическим путем с использованием химический, а иногда энзиматических методов их конденсаций. Такой подход был применен, в частности, для получения проинсулина человека. присоединением ряда синтетических пецтидных звеньев к выделенным из природного инсулина А- и В-цепям.
2.3. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ
Протеолитические ферменты в обычных условиях катализируют гидролиз пептидных связей. Однако могут быть подобраны такие условия, при которых равновесие оказывается сдвинутым в сторону образования пептидной связи. Так, в концентрированных растворах бензилоксикарбонил-Ь-аспарагиновой кислоты и метилового эфира L-фенилаланина металлопротеиназы, например термолизин, катализируют образование пептидной связи между ними, причем продукт реакции (метиловый эфир бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина), будучи малорастворимым, выпадает в осадок в виде соли с еще одной молекулой метилового- эфира L-фенилаланина. Именно эта низкая растворимость продукта, которая выводит его из сферы реакции, смещает равновесие в сторону синтеза. Цосле снятия защитной группы каталитическим гидрированием получают метиловый эфир L-асп^ртил-Ь-фенилаланина — аспартам — соединение, превосходящее сахарозу по сладости в 200 раз. Процесс использует для промышленного получения аспартама:
СООН С бЩ
I I
„ч СН2 СН2
I I
Металлопротеиназа
,ч CeHsCHzO-CO-NH-CH—COOH + NH2—СН—С00СН3 ¦ ^ ¦ “ - >
Бензилоксикарбонил-L- Метиловый эфир
г аспарагиновая кислота L-фенилаланина
СООН С6Н5
II
. сн2 сн2
I I
-» CeHjCHjO-CO-NH-CH—C0-NH-CH—СХЮСНз--------
' (fl Метиловый эфир бензилоксикарбонил- Удаление защитной группы
Ь-аспартил-Ь-фенилаланина каталитическим гидрированием
H2/Pd
/
I
—* NHj-СИ—CO-NH-OB—СООСНз Метиловый эфир L-аспартил-L-фенил аланина (аспартам)
Еще один способ смещения равновесия в сторону синтеза — проведение катализируемой протеиназой реакции пептидною синтеза в органическом растворителе в присутствии малых количеств воды, достаточных только для гидратации фермента. Применяют при ферментативном синтезе и предварительную активацию одного из компонентов. Так, эфиры ацилированных пептидов в присутствии сериновых протеиназ быстро реагируют с аминокомпонентами — производными аминокислот или пептидов, образуя более .длинные пептиды. Сдвиг равновесия в сторону синтеза в этом случае обеспечен активацией ацилирующею пептида за счет его превращения в сложный эфир; скорость катализируемого ферментом синтеза пептидной связи из эфира пептида гораздо выше скорости гидролиза этой же пептидной связи ферментом.
