Энергетика биологических мембран - Скулачев В.П.
ISBN 5-02-004027-4
Скачать (прямая ссылка):
В дальнейшем эффект ДЦКД был детально изучен Хатефи, Фишером и их коллегами [1179, 1191, 1192]. Оказалось, что NAD(H), а также ADP и АМР, связывающиеся с местом присоединения NAD(H) к трансгидрогеназе, защищают фермент от тормошения ДЦКД. NADP(H), 2'-АМР и З'-АМР не обладают таким свойством. Для выключения протонтранспортной активности трансгидрогеназы достаточно добавить 0,5 моля ДЦКД на моль фермента [1192], принимая молекулярную массу последнего равной 120 кДа [733, 1630]. Такая стехиометрия может объясняться димерной организацией трансгидрогеназы [165, 1629]. Было высказано предположение [1192], что ДЦКД атакует один из двух идентичных 120 кДа-мономеров в димере, инактивируя весь димер. Подобные соотношения были описаны для фактора F1? в котором модификация всего одной из трех fS-субъединиц посредством ДЦКД почти полностью инактивирует АТРазу [1192].
Существенным моментом трансгидрогеназного механизма является то обстоятельство, что при этой реакции имеет место прямой стереоспецифический перенос Н' между положением А ни-котинамидного кольца NAD и положением В такового NADP. При этом неАпроисходит обмена протонами с водой [914]. Следовательно, протоны, транспортируемые ферментом через мембрану, не идентичны тем протонам, которые переносятся от одного ни-котинамиднуклеотида к другому при трансгидрогеназной реакции.
Как NAD(H), так и NADP(H) взаимодействуют с той стороной трансгидрогеназы, которая смотрит в матрикс митохондрии (или цитоплазму бактериальной клетки). В то же время существуют необходимые для активности трансгидрогеназы функциональные группы, экспонированные в воду на противоположной стороне мембраны. Было показано, что непроникающий фотоактивный модификатор белка, заключенный в трансгидрогеназные протео-липосомы, при освещении включается в фермент, причем эффект стимулируется добавлением в среду инкубации NADP+ и 3-аце-тилпиридиннуклеотида, тормозится посредством NADH и не изменяется NADPH. Можно заключить, что связывание субстратов меняет конформацию домена трансгидрогеназы, локализованного по другую сторону гидрофобного барьера [1180]. Как было пока-
246
5. Потребители ЛцН
зано в нашей лаборатории, непроникающий реагент на SH-группы ингибирует трансгидрогеназу, будучи добавленным со стороны, противоположной субстратсвязывающему домену.
Как уже отмечалось выше, мономер митохондриальной Н+-трансгидрогеназы представляет собой один очень длинный полипептид массой 1?0 кДа. В Е. coli аналогичный фермент состоит из двух полипептидов, суммарная масса которых чуть меньше таковой мономера митохондриальной трансгидрогеназы. ДЦКД взаимодействует с большей субъединицей (50 кДа), не влияя на меньшую (47 кДа). При включении в протеолипосомы фермент из Е. coli образует Д]Щ. Процесс блокируется ДЦКД [3883.
Принцип действия Н+-трансгидрогеназы остается неясным. Известно, что АрН не только смещает равновесие в сторону восстановления NADP+, но и резко ускоряет этот процесс. Фактически первое описание энергозависимой трансгидрогеназы [425] было связано с действием на кинетику процесса, и лишь впоследствии был продемонстрирован термодинамический эффект, т. е. сдвиг равновесия [914]. Показано, что А]1Н снижает Кт трансгидрогеназы для NADP с 40 до 6,5 мМ и повышает Кт для NAD' с 28 до 43,5 мМ. Таким образом, Д]Щ благоприятствует восстановлению NADP+ и затрудняет восстановление NAD+ [1284].
Существует несколько весьма спекулятивных схем, пытающихся объяснить этот феномен (см. обзоры: [1283, 1284]). Ни одна иэ них не имеет сколько-нибудь серьезного экспериментального подтверждения.
5.1.3.3- Биологические функции
Безусловно главная функция Н+-трансгидрогеназы состоит в поддержании высокого соотношения [NADPH]/[NADP+], что стимулирует восстановительные синтезы. Последние включают, как правило, один или несколько этапов, на которых происходит окисление NAD PH. Фактически энергия, вырабатываемая дыхательной или фотосинтетической редокс-цепью в виде АрСН, становится при посредничестве трансгидрогеназы дополнительной движущей силой восстановительных биосинтезов:
Свет, дыхание-—--—» ДйН—--—>NADPH-^
ДцН-генераторы н+-трансгидрогеназа
—> Восстановительные синтезы. (30)
Так обстоит дело в митохондриях и в подавляющем, большинстве бактерий, у которых отсутствует нециклическая фотоцепь.
В хлоропластах и цианобактериях проблема поддержания высокого соотношения [NADPH]/[NADP+] решается восстановлением NADP+ в качестве конечного акцептора электронов редокс-цепи. Неудивительно, что Н+-трансгидрогеназа в хлоропластах отсутствует.
5.1. Химическая работа за счет ДиЯ
247
Рассматривая возможные дополнительные функции Н+-транс-гидрогеназы, мы должны иметь в виду, что это — единственный генератор, способный, в принципе говоря, образовывать AjIH обратной полярности. Конечно, такой эффект требует весьма спе-дифических условий, а именно избытка NADH и NADP+ по сравнению с NAD+ и NADPH и полного выключения всех прочих AjIH-генераторов. Образование обратной AjIH должно изменить направление всех Д]1Н-зависимых транспортных процессов (см. подробнее [126]).
