Энергетика биологических мембран - Скулачев В.П.
ISBN 5-02-004027-4
Скачать (прямая ссылка):
232
5. Потребители Л fill
а-субъединицу, а затем транслоцируются на погруженную в мембрану р-субъединицу, несущую каталитический центр.
Некоторые наблюдения, сделанные в нашей группе, могут рассматриваться как свидетельство в пользу выдвинутых представлений.
1. Гидролиз АТР изолированным фактором Fx чувствителен к водорастворимым модификаторам каталитического центра на Р-субъединице, в то время как АТРазная активность субмитохон-дриальных частиц и интактных митохондрий не чувствительна к этим ингибиторам. В опытах использовали смешанный ангидрид АТР и мезитиленкарбоновой кислоты (АТР-МС) и водорастворимое производное карбодиимида, а именно 1Ч-циклогексил-1Ч'-р-(4-ме-тилморфолин)-этилкарбодиимид (ЦМКД). Такие соотношения можно объяснить предположением, что каталитический центр доступен для водной фазы в изолированном Fx и экранирован от нее в Fx, связанном с мембраной.
В соответствии с этим наблюдением было найдено, что [3Н] — АТР-MG включается в р-субъединицу только в изолированном факторе Fj.
2. Удаление ос-субъединицы сенсибилизирует АТРазу субмито-хондриальных пузырьков к АТР-МС, указывая, что а-субъедини-ца закрывает каталитический центр в мембранно-связанном Fx.
3. Водорастворимые модификаторы некаталитического центра на а-субъединице, а именно ADP-МС и окисленное (диальдегид-ное) производное ADP (oADP), снижают АТРазную активность пузырьков, но не изолированного фактора Fx. Это показывает, что а-субъединица как-то участвует в процессе, когда он происходит в мембранной системе.
4. В митохондриях, но не в вывернутых пузырьках АТРаза может быть сенсибилизирована к АТР-МС и ЦМКД посредством обработки бутанолом, который, по-видимому, демаскирует каталитический центр Р-субъединицы, локализованный не слишком далеко от внешней поверхности митохондриальной мембраны (см. обзор: [1422]).
Для рассматриваемой схемы существен обмен нуклеотидами между каталитическими и некаталитическими центрами фактора Fx (см., однако, [1606]).
Другая возможность состоит в том, что нуклеотидсвязываю-щие места на а-субъединицах участвуют в регуляции фактора Fx. В этом случае р-оубъединица осуществляет как катализ, так и транслокацию субстратов и продуктов реакции.
Как уже отмечалось выше, А. Д. Виноградовым и соавт. [1039] было показано, что нуклеотиды оказывают мощное регулирующее воздействие на Н+—АТР-синтазу. Оказалось, что ADP тормозит гидролиз АТР изолированным фактором Fx двумя совершенно различными способами — конкурентно и неконкурентно по отношению к АТР. В первом случае ADP взаимо-
5.1. Химическая работа за счет ДцН
233
действовал с местом слабого связывания нуклеотидов, во втором — с местом их прочного связывания. Ингибирование в месте прочного связывания потенциировалось азидом, эффект которого снимался сульфитом. Азид, а также белковый ингибитор фактора Гх не влияли на синтез АТР при дыхании [1558]. А. Д. Виноградов заключил, что во-первых, существуют две изоформы фактора Fj, одна из которых приспособлена для синтеза, а другая — для гидролиза АТР, и, во-вторых, прочное связывание ADP фиксирует фермент в его «синтетической» изоформе ([34, 1039, 1558]; см. также [552]). Есть и другие косвенные указания на различие путей синтеза и гидролиза АТР в Н+—АТР-синтазе (см., например, [1542]).
Остается неясным, каким именно образом А|1Н вызывает антипорт ATP/(ADP + Р*) между каталитическим центром и водой. Одно из предположений [134, 1422] состоит в том, что различие в числе отрицательных зарядов между полностью ионизованным АТР (четыре) и ADP + Р; (шесть) может иметь решающее значение. Приняв (рис. 77, а), что Mg2+ и катионные лиганды (L+) полностью нейтрализуют ADP3- и РО|~ в комплексе [ADP3~-POf~-
• Mg2+-4L+], мы приходим к ситуации, когда комплекс АТР4-с теми же лигандами несет два положительных заряда. Если каталитический центр фактора Fx погружен в мембрану, т. е. находится в сфере действия АТ, перенос [ATP4_-Mg2+*4L+]2+ из глубины мембраны в матрикс должен происходить электрофоретичес-ки. Что касается АрН, которая так же эффективна, как АТ в качестве движущей силы, то она может превращаться в локальную AlF при протонировании или депротонировании каких-то фиксированных функциональных групп (X и Y на рис. 77, а) в комплексе FqFx [1422].
То, что транслокация АТР через Fx действительно поддерживается энергией А]Ш, было показано в нашей лаборатории [377, 1422], когда изучалось торможение АТРазы субмитохондриальных пузырьков, не гидролизуемых аналогом АТР, 5-аденилилимидо-фосфатом (AMPPNP). Короткая предынкубация пузырьков, выдерживавшихся с AMPPNP, в среде с сукцинатом в аэробных условиях полностью снимала торможение АТРазной активности, если ее измеряли в присутствии разобщителя, добавленного после сукцината. Если же разобщитель был добавлен в среду с суб-митохондриальными пузырьками до сукцианата, торможение сохранялось. Именно таких соотношений можно было ожидать, если АрН, генерируемая при окислении сукцината, удаляет AMPPNP из каталитического центра.
В рамках рассматриваемой концепции роль фактора F0 состоит в транслокации ионов Н+ между внешней (по отношению к митохондрии) водной фазой и областью мембраны, где располагаются фиксированные протонакцепторные группы X. Судьба этих протонов может быть двоякой. Если стехиометрия Н+/АТР
