Энергетика биологических мембран - Скулачев В.П.
ISBN 5-02-004027-4
Скачать (прямая ссылка):
226
5. Потребители AfiH
вается кривой с насыщением (Кт=10"7 М), что указывает на наличие места связывания иона Н+ [799]. Кагава и соавт. [1437] детально изучили фактор F0 термофильной бактерии PS3. Было показано, в частности, что Кт сдвигается до 7 • 10~7 М после йодирования Туг-69 в с~субъединице (при йодировании снижается рКа тиро-зинового гидроксила). Модификация тирозина тетранитрометаном полностью прекращает перенос протонов. Кагава [799] предположил, что Туг-69 прямо участвует в транспорте Н+. Кроме того, он обнаружил, что модификация Arg-Зб и Arg-41 в с-субъединице бактерии PS3, как и блокирование GIu-56 посредством ДЦКД, выключают протонный перенос. На основе этих наблюдений, а также косвенных соображений относительно упаковки фактора F0 в мембране была высказана гипотеза, что протон переносится по следующему маршруту: вода -> Туг-69 Glu-56 -> Arg-36 (или 41) вода [799].
В то же время Кокс и соавт. [407], исследовавшие фактор F0 Е. coli, предположили, что Непроводящий путь образован остатками глутамата, серина, лизина, аргинина и аспарагина в четвертой (от N-конца) а-спирали а-субъединицы и Asp-61 с-субъединицы. В четвертой а-спирали митохондриальной субъединицы 6 на тех же местах находятся соответственно глутамат, серин, глицин, аргинин и аспарагин.
Скорость переноса Н+ через фактор F0 бактерии PS3 оказалась около 75 H+-c“1-Fo1 при AjIH порядка 95 мВ (25°). Столь медленная скорость делает крайне маловероятным предположенне, что перенос Н+ идет по фиксированной цепочке водородных связей белка. По-видимому, движение Н+ требует каких-то конформа-ционных изменений в факторе F0, вызывающих сближение и расхождение групп, переносящих протоны [799, 800].
Недавно Юнге и соавт. [1329] получили гораздо более высокие значения Непроводимости для фактора F0 хлоропластов, а именно 6200 H+/c-CF0 при А? = 100 мВ. Однако даже эта величина, вероятно, слишком низка для Непроводящего механизма типа канала.
Шиндлеру и Нельсону [1316] удалось встроить субъединицу 9 из дрожжевых митохондрий в плоскую фосфолипидную мембрану и показать возникновение протонной проводимости, чувствительной к ДЦКД. По-видимому, субъединица 9 из митохондрий (а также из хлоропластов [1386]) в отличие от ее бактериального аналога — с-субъединицы не требует других компонентов фактора F0 для организации Непроводящего пути. Субъединицы 9 образовывали в плоской мембране действующие независимо одиночные «каналы». Как и в опытах на природных мембранах, проводимость «канала» оказалась гораздо более низкой, чем можно было бы ожидать, если бы перенос ионов Н+ происходил по поре: через «канал» проходило всего около 100 ионов Н+ в секунду при pH
5.1. Химическая работа за счет Д.иН
227
7,0 и А? = 100 мВ [1316]. Проводимость по К+, Na+ и СГ была по крайней мере в 103 раз ниже, чем по Н+ [1316].
Характерной чертой митохондриального фактора F0 является его чувствительность к олигомицину. Выделены мутанты дрожжей, у которых Непроводимость через F0 резистентна к этому антибиотику. Ответственными за резистентность оказались два локуса в субъединице 6. Оба они консервативны у человека и мыши. В то же время в а-субъединице Е. coli, гомологичной митохондриальной субъединице 6, обнаружен только один из консервативных локусов [5901, что согласуется с наблюдением о слабом эффекте олигомицина на Н+—АТР-синтазу Е. coli. Тем не менее олигомицин препятствует связыванию [14С]-ДЦКД с с-субъеди-ницей в факторе F0 Е. coli. Вентурицидин не только препятствует связыванию ДЦКД, но и тормозит перенос Н+ фактором F0 Е. coli (1182].
Среди прочих бактерий, исследованных на этот предмет, только Rh. rubrum имеет перенос Н+, чувствительный к олигомицину. Отметим, что Rh. rubrum — довольно близкий сосед митохондрий на эволюционном «дереве» (см. раздел 7.4, рис. 125). Чувствительность фактора F0 Rh. rubrum к олигомицину как-то связана с функцией р-субъединицы фактора Fx. Показано, в частности, что достаточно заменить Р-субъединицу в Н+—АТР-синтазе Rh. rubrum на р-субъединицу из Е. coli, как олигомицин перестает действовать на эту систему [652].
Недавно появились сообщения об участии бактериальных «- и 6-субъединиц в транспорте Н+. Было установлено, что Glu-131 в 6-субъединице существен для протонной проводимости, создаваемой фактором F0 [1199]. В то же время удаление большой части 6-субъединицы, экспонированной в воду, не тормозит перенос ионов Н+ и не препятствует связыванию ДЦКД, хотя последующая реконструкция такого F0 с фактором Fx дает FqFj-kom-плекс, гидролизующий АТР ДЦКД-нечувствительным способом 1293]. Таким образом, Ь-субъединица участвует в организации Правильного контакта факторов Fx и F0.
Для этого контакта необходима также б-субъединица фактора Fx, белок, имеющий форму палочки и в основном состоящий ш а-спиралей. Мутант Е. coli с измененной б-субъединицей не способен к генерации А]1Н за счет АТР, а отделение фактора Fj от мембраны не повышает ее проводимости для протонов. Полагают, что измененная б-субъединица остается в мембране после отделения Fj, закрывая вход в Непроводящий путь фактора F0 [293].
