Энергетика биологических мембран - Скулачев В.П.
ISBN 5-02-004027-4
Скачать (прямая ссылка):
Сравнение аминокислотных последовательностей факторов Fx из ми тохондрий, хлоропластов и бактерий показало, что в р-субъ-
224
5. Потребители ДцН
единице есть гомологичные последовательности, образующие два кластера — кислый и основный: AspGluLeuSerGluGluGluAsp и ArgAlaArgLysIleXArg (соответственно остатки 381—387 и 393 и 399 в факторе Fx из Е. coli) [1282]. Кагава полагает [801], что перенос протонов происходит от F0 к основному и далее к кислому кластеру внутри молекулы F2. По его схеме, этот эффект приводит к конформационному изменению фактора F1; вызывающему освобождение протонов и синтезированного АТР в водную среду, омывающую ту поверхность мембраны, куда обращен F2. Схема Кагавы нуждается в дальнейшем исследовании. Однако уже сейчас ясно, что карбоксильные и аминные группы, а также остатки тирозинов как-то вовлечены в механизм гидролиза АТР фактором F2 [293, 801, 802]. Один из существенных карбоксилов фактора Fx модифицируется ДЦКД. Этот эффект следует отличать от тормозящего действия ДЦКД на протонную проводимость фактора F0, развивающегося при меньших концентрациях ингибитора [1200].
Несколько независимых линий доказательства свидетельствуют о том, что гидролиз АТР в каталитическом центре Fx происходит путем прямой атаки молекулой воды ангидридной связи АТР, как это показано в уравнении (25):
Н-
ADPO
•ОН он ОН
/ I
—Р=0 —» AUPOH -(- НО—Р=0. (25)
Ч°н ОН
Процесс протекает без образования ковалентных интермедиатов.
Об этом свидетельствуют как данные опытов по изотопным обменам, так и факт, что гидролиз АТР фактором F2 устойчив к ванадату, гидроксиламину и другим реагентам на ацилфосфат [134, 1421, 1579].
5.1.1.4. Синтез связанного АТР изолированным фактором Fx
В 1982 г. Фелдмэн и Сигмэн [553] показали, что фактор CFlt изолированный из хлоропластов, может синтезировать АТР из прочно связанного ADP в ответ на добавление в раствор неорганического фосфата. Синтезированный АТР оставался связанным с CFlt был недоступен для гексокиназы и мог быть переведен в раствор только путем денатурации фактора CFj. Позднее те же авторы продемонстрировали синтез связанного АТР полностью деэнергизованными хлоропластами [554], подтвердив в этой системе предположение, сделанное за десять лет до них Кроссом и Бойером, исследовавшими разобщенные митохондрии [413]. В 1983 г. Сакамото иТоно-мура [1292] сообщили о синтезе связанного АТР из ADP и фосфата, добавленных к раствору митохондриального фактора F2. Процесс резко стимулировался 30%-ным диметилсульфоксидом.
5.1. Химическая работа за счет ЛиН
225
Эти наблюдения показывают, что AJTH требуется скорее для удаления АТР из активного центра Fx (или прочного связывания ADP и Рг с этим центром), чем для синтеза АТР как такового.
Стимулирующий эффект диметилсульфоксида может объясняться снижением активности воды в каталитическом центре (что должно сдвинуть влево равновесие реакции АТР+Н20 ^ ^ ADP+P;), а также повышением сродства этого центра к фосфату [1291]. Здесь уместно отметить, что образование Е2—Р [442] и АТР [378] из добавленных фосфата и ADP было показано в опытах на очищенной Са2+—АТРазе в присутствии высокой концентрации диметилсульфоксида.
Теоретический расчет, сделанный в нашей группе [1422], показывает, что константа равновесия гидролиза АТР в каталитическом центре фактора Fx не превышает 100, а, по всей вероятности, близка к 1. Это означает, что синтез связанного АТР требует гораздо меньшего количества энергии, чем синтез свободного АТР в растворе.
Представляется возможным даже, что практически вся энергия тратится на стадии освобождения АТР (или связывания ADP и фосфата), как это было впервые предположено Бойером [292] (см. также ниже раздел 5.1.1.8).
5.1.1.5- Проведение протонов через фактор F0
Удаление фактора F2 из тилакоидов, хроматофоров, суббактери-альных или субмитохондриальных пузырьков приводит к появлению протонной проводимости через фактор F0. Протеолипосомы с фактором F0 также имеют высокую проводимость по протонам. Эффект снимается добавлением специфического блокатора F0 — ДЦКД. Реконструкция фактора F0 с фактором Fj также подавляет утечку протонов (см. обзоры: [134, 293 , 584, 1421].
В опытах с бактериями показано, что мутация по любой из трех субъединиц фактора F0 приводит к потере его способности проводить протоны [183, 293, 584, 590, 1199]. Весьма вероятно, что с-субъединица прямо участвует в переносе Н+. В с-субъединице фактора F0 есть остаток дикарбоновой кислоты, абсолютно необходимый для переноса протонов. Он располагается на расстоянии 1,8 нм от поверхности мембраны, т. е. примерно в середине гидрофобного барьера [1212]. В Е. coli остаток, о котором идет речь,— это Asp-61. Его модификация посредством ДЦКД [1095] или замена на Asn или Glu [737, 738] полностью прекращает как транспорт Н+, так и синтез АТР за счет Д]1Н. В с-субъединице из других бактерий, а также в субъединице 9 из митохондрий на месте Asp-61 состоит глютамат, также специфически атакуемый ДЦКД [1531].
Как отмечает Кагава, F0 вряд ли представляет собой просто пору, так как зависимость скорости переноса Н+ через F0 описы-
