Энергетика биологических мембран - Скулачев В.П.
ISBN 5-02-004027-4
Скачать (прямая ссылка):
Гидролиз АТР растворимым фактором Fx был исследован в целом ряде лабораторий, однако и сегодня многие существенные моменты механизма этой реакции остаются неясными.
Твердо установлено, что фактор Fj может связывать шесть молекул адениннуклеотидов, т. е. по одному на каждую крупную субъединицу [134, 1421].
Как а-, так и Р-субъединицы фактора Fx содержат весьма консервативные последовательности, подобные тем, что найдены в других ATP-связывающих ферментах [293, 1570]. Из шести мест связывания три гораздо быстрее обменивают связанные нуклео-
222
5. Потребители ДцН
тиды, чем три других места. Поэтому в факторе Fj различают прочно и слабо связанные нуклеотиды [134, 293, 1421].
Имеется несколько косвенных указаний на то, что активный центр фактора Fj расположен на Р-субъединице. Недавно появилось сообщение [687], что изолированная Р-субъединица фактора Fj из Rhodospirillum rubrum гидролизует, хотя и очень медленно, АТР до ADP и фосфата. Гидролиз тормозится такими специфическими ингибиторами фактора Fj, как ауровертин и эфрапептин. Первый из них снижал АТРазу в пять раз, второй — втрое. Такая же степень торможения активности наблюдалась на интактном Fj. Умакс и &т для гидролиза Mg2+—АТР р-субъединицей и фактором Fj были того же порядка. Однако FManc Для расщепленияСа2+— АТР оказалась в 400 раз ниже в случае Р-субъединицы, чем фактора Fx. Фактически Р-субъединица расщепляла Са2+—АТР так же медленно, как Mg2+—АТР. Кроме того, активация АТРазы сульфитом и ее ингибирование азидом наблюдались только на факторе F1? но не на Р-субъединице. В отличие от фактора Fj Р-субъединица не содержала связанных нуклеотидов.
Все эти наблюдения подобны таковым, сделанным при исследовании фактора Fj в условиях, когда заполняется только один каталитический центр [653] (так называемый одноцентровый катализ). Связывание АТР во втором месте вызывает многократное ускорение реакции, что обусловлено возрастанием скорости освобождения продуктов (ADP и фосфата) из активного центра.
Приняв, что Р-субъединицы несут каталитические центры, мы должны предположить, что все другие субъединицы фактора Fj имеют регуляторные или какие-то иные функции. В этой связи можно напомнить, что фактор Fj из Lactobacillus casei (см. выше раздел 4.2) состоит из тех же крупных субъединиц, что и из Е. coli, катализирует быстрый гидролиз АТР in vitro и действует in vivo в основном или даже исключительно как АТРаза, хотя может синтезировать АТР на искусственно созданной Д?\ Из этих наблюдений можно заключить, что: 1) комплекс шести крупных субъединиц (За + Зр ) необходим для быстрой скорости реакции, катализируемой фактором Fj, и 2) наличие двух типов крупных субъединиц обязательно для достижения высокой скорости гидролиза и синтеза АТР как таковых.
Может быть, гетерогенность крупных субъединиц в Н+—АТР-синтазе необходима для улучшения кинетических характеристик процесса синтеза АТР. В то же время весьма вероятны также эффекты регуляторной природы. Дело в том, что очень активная Н+—АТР-синтаза, действуя в обратном (гидролитическом) направлении, может практически немедленно исчерпать весь запас АТР в клетке. К счастью, расщепление АТР Н+—АТР-синтазой сдерживается генерируемым ею протонным потенциалом, когда Д?Ш достигает величины, эквивалентной энергии гидролиза АТР
.?Afrfepgb'1
5.1. Химическая работа за счет ЛиН
223
(феномен протонного контроля). Тем не менее этот регуляторный механизм не всегда достаточен, так как иногда высокая AjIH не может поддерживаться вследствие повреждения мембраны или активации природной разобщающей системы (см. ниже раздел 5.4.2). В таких условиях могут помочь аллостерические регуляторы. По крайней мере два таких регулятора действуют на уровне фактора Fj. Это ADP и белковый ингибитор.
Как показали А. Д. Виноградов и соавт. [1039, 1559J, гидролиз АТР изолированным митохондриальным фактором Fj сильно тормозится одним из продуктов реакции — ADP. По данным, полученным в пашей группе Я. М. Мильгромом и М. Б. Мура-талиевым [92], это торможение обусловлено ADP, связанным в некаталитическом центре фактора Fj.
Примечательно, что торможение посредствм ADP отсутствует при гидролизе АТР изолированной Р-субъединицей фактора Fx из Rh. rubrum [687]. В этой связи интересно было бы выяснить, как действует ADP на фактор Fj из L. casei (см. обсуждение [91]).
Естественный механизм удаления ADP из ингибированного фактора Fj требует AjIH [377, 881, 1408]. Это означает, что торможение посредством ADP может развиваться только в том случае, если AJTH снижен, т. е. именно тогда, когда есть опасность исчерпания фонда АТР в клетке.
В митохондриях ту же функцию, что ADP, может выполнять особый полипептид—белковый ингибитор [581]. В хлоропластах, он по-видимому, идентичен е-субъединице [560].
Подобно ADP, белковый ингибитор подавляет АТРазную активность изолированного фактора Fj, а также комплекса F,^ в мембране в условиях, когда AfUH снижен (см. обзоры: [881, 1340]).
Вероятно, роль а-субъединицы не ограничивается регуляцией активности р-субъединицы. Как было постулировано в нашей группе [134, 1421], связывание АТР, ADP и фосфата с а-субъеди-ницей может служить промежуточным этапом транслокации этих гидрофильных веществ из воды в активный центр р-субъединицы, локализованный в гидрофобной области (см. ниже раздел 5.1. 1.8). Что же до мелких субъединиц (у, б, е), то они могут быть вовлечены как в регуляцию, так и в организацию комплекса FoF^ По Кагаве, комплекс а-, р- и 7-субъединиц представляет собой минимальную систему, все еще способную к быстрому гидролизу АТР [799]. В то же время сумма у-, 8- и е-субъединиц достаточна для блокирования пассивной утечки протонов через фактор F0 в субклеточных пузырьках бактерий, предварительно лишенных фактора Fx [799]. Это и некоторые другие наблюдения свидетельствуют о том, что мелкие субъединицы фактора Fj участвуют в > его прикреплении к F0.
