Энергетика биологических мембран - Скулачев В.П.
ISBN 5-02-004027-4
Скачать (прямая ссылка):
2) существует Н+-проводящий путь от поверхности мембраны к Qb- Ионы Н+ движутся по этому пути к восстановленному Qb ж протонируют его с образованием QH2.
Чтобы выбрать один из вариантов, мы исследовали эффект двух последовательных лазерных вспышек длительностью 30 не.
3.1. Циклическая светозависимая редокс-цепь
7»
/-л rfcmuixiz
Рис. 30. Генерация Л? комплексами реакционных центров Rps. viridis в ответ на две последовательные 15-наносекундные вспышки лазера, данные с интервалом 0,5 с
Момент вспышки показан вертикальной стрелкой. Видно, что только вторая вспышка вызывает появление «медленной» (микросекундной) электрогенной стадии (а). На рис. б эта стадия показана при большем разрешении, где пунктирная и сплошная линии означают соответственно первую и вторую вспышку. CoQ,„ был добавлен в раствор для пропитки пленки. Редокс-потенциал среды +240 мВ (по: Драчева и соавт. [503])
Если верен первый вариант, обе вспышки должны вызвать появление медленной электрогенной стадии. В альтернативном случае такая стадия будет возникать только при второй вспышке, так как CoQv, образующийся в результате первого однократного срабатывания реакционного центра, не протонируется при физиологических значениях pH. Протонирование происходит после присоединения второго электрона, для чего необходима вторая вспышка.
Как показано на рис. 30, только вторая вспышка дает медленную электрогенную стадию. Это означает справедливость второго варианта, предполагающего перенос Н+ из воды к месту локализации Qb внутри комплекса реакционных центров [503]. Допустив постоянство диэлектрических свойств гидрофобного барьера мембраны по всей ее толщине, мы можем оценить, какую часть этого барьера проходит Н+. Поскольку медленная стадия составляет 10% от всего электрического ответа на вторую вспышку света, можно было бы принять, что протон перено-
74
3. Первичные АцН-генераторы
Рис. 31. Генерация А? комплексами реакционных центров Rps. viridis: роль высокопотенциальных гемов цитохрома с
Измерение проводилось при ре-докс-потенциале среды (Е) + 220 мВ (1) (два высокопотенциальных гема тетрагемового цитохрома с восстановлены, а два низкопотенциальных — окислены), + 380 мВ (2) (50%-ная степень восстановленное™ одного из высокопотенциальных гемов) и при +440 мВ (3) (все четыре гема окислены). Справа (б) дана часть рис. а более крупным планом (по: Дра чева и соавт. [503])
Рис. 32. Механизм и соотношение электрогенных стадий в образовании Д? комплексом реакционных центров Rps. viridis
Вклад каждой стадии приведен применительно к ответу на вторую вспышку света. При расчете на одну вспышку в среднем вклад переноса Н+ уменьшится с 10% до 5%, а вклады остальных стадий, связанных с переносом электрона, соответственно возрастут
3.1. Циклическая светозависимая редокс-цепь
75
сится на 1/10 часть толщины мембраны [503]. Дальнейшее иссле-^ дование, однако, показало, что реальная ситуация не столь проста.
Чтобы оценить вклад цитохрома с, мы использовали условия, при которых два гема цитохрома с (а именно с656 и е669) были восстановлены. CoQ не добавляли, чтобы избежать появления элек-трогенных стадий, сопровождающих протонирование CoQ2”.
Было показано, что вспышка лазера, вызывающая фотоокисление (БХл)2, приводит к временному окислению этих гемов (полувремена около 300 не для гема с669 и 3 мке для гема сььв). Окисление гемов сопровождается генерацией А1?, которая также носит двухфазный характер, кинетика каждой из фаз соответст-ствует таковой окисления гемов. Вклады быстрой и медленной цитохромных электрогенных фаз в общую А1? оказались соответственно 15 и 5% (рис. 31) [503].
На рис. 32 приведена схема, иллюстрирующая структурнофункциональные характеристики реакционных центров Rps. vi-ridis. Расстояния между редокс-группами соответствуют данным рентгеноструктурного анализа. Поверхности мембраны проведены достаточно условно, поскольку точных сведений по этому поводу пока нет. Вследствие этого мы не можем ответить, например, на вопрос, почему перенос Н+ от цитоплазматической стороны мембраны к CoQ дает всего лишь 10% общего Д?: то ли путь протона (из воды к CoQ) короче, чем путь электрона (от цитохрома с к CoQ), то ли Н+ переносится через менее гидрофобную часть комплекса. Вероятнее всего, играют роль оба эти фактора. Именно такова, по-видимому, ситуация на тех этапах, где переносится электрон. Расстояние между Qa и (БХл)2, (БХл)2и е569, с669 ис656 по оси, вертикальной к плоскости мембраны, равны соответственно 2,9, 2,1 и 1,2 нм. Если бы вклад каждой из этих стадий в общий электрогенез определялся только расстоянием между редокс-группами, то вклады относились бы друг к другу как 1:0,7:0,4. В действительности же соотношение между ними 1:0,2:0,07. Это означает, что вклад тем больше, чем глубже данный этап переноса электрона погружен в мембрану. Такая закономерность становится понятной, если учесть, что величина диэлектрической постоянной в мембране должна возрастать по мере приближения к водной фазе.
Когда Митчел в 1960-е годы формулировал свою хемиосмоти-ческую гипотезу, он предположил, что электрон, двигаясь от цитохрома с к CoQ через БХл, пересекает гидрофобный барьер мембраны (электронтранспортная «полупетля») [1046, 1047]. Это предположение, в то время чисто умозрительное, сегодня прямо Доказано. Единственный новый момент, выявленный в результате экспериментальной проверки гипотезы, состоит в том, что существует небольшая, но измеримая электрогенная стадия, обусловленная не переносом электрона, а встречным движением протона,, необходимого для образования CoQH2 из CoQ2-.
