Энергетика биологических мембран - Скулачев В.П.
ISBN 5-02-004027-4
Скачать (прямая ссылка):
9.4. AjiH на реконструированных мембранах
Главная трудность в интерпретации измерений Д]Ш на природных мембранах состоит в сложности исследуемой системы, включающей множество ферментов и переносчиков. Например, не иск-ключено, что ДцН — не интермедиат, связывающий дыхание и Н+—АТР-синтазу, а побочный продукт одного из этих двух механизмов.
Чтобы упростить ситуацию, были предприняты исследования по реконструкции ^юдельных мембран, инкрустированных каким-либо одним ДjiH-генератором. Первые публикации такого
438
9. Исторический очерк исследований по энергетике биомембран
рода опытов появились из лаборатории Ракера в самом начале 1970-х годов. Кагава и Ракер [804] реконструировали мембранные пузырьки из фосфолипидов и митохондриальной Н+—АТР-синтазы. Опыты с применением валиномицина и разобщителя указывали на ATP-зависимую генерацию АрН.
Подобный подход был вскоре применен Хинклем и др. [728] в группе Ракера и А. А. Ясайтисом и др. [774] в нашей группе с целью реконструкции цитохромоксидазного ДрН-генератора. Добавив в среду реконструкции цитохромоксидазу и Н+—АТР-синтазу, Ракер и Кэндрэч [1228] получили пузырьки, синтезировавшие АТР при переносе электронов с восстановленного цитохрома с на кислород. Обязательное условие состояло в том, что донором электронов служил цитохром с, заключенный внутрь пузырька. Если действовал также и внешний цитохром с, то дыхание уже не поддерживало синтеза АТР.
В рамках гипотезы Митчела ингибиторный эффект внешнего цитохрома с можно было легко объяснить, предположив, что в реконструированных пузырьках имелись две популяции цито-хромоксидаз, ориентированных противоположным образом. Включение как тех, так и других приводило к генерации протонных потенциалов противоположного знака, так что результирующая ДрН оказывалась незначительной по своей абсолютной величине.
Чтобы проверить это предположение, мы применили метод проникающих ионов и показали, что протеолипосомы с цитохром-оксидазой и Н+—АТРазой генерируют АТ внутри со знаком «минус» при окислении внешнего цитохрома с и со знаком «плюс» при окислении внутреннего цитохрома с или при гидролизе АТР [774]. Эти результаты были подтверждены затем в других лабораториях посредством различных индикаторов АТ и АрН (см. обзоры: [684, 1226, 1227]), а также в нашей лаборатории с использованием прямой регистрации АТ вольтметром [226, 487, 488, 490, 871].
Эксперименты, описанные выше, ясно показали необходимость АрН для окислительного фосфорилирования и способность как дыхательной цепи, так и митохондриальной АТРазы генерировать АрН одного и того же направления.
9.5. Образование АТР за счет искусственно созданной ДрН
Итак, АрН необходима для синтеза АТР в митохондриях, хло-ропластах и бактериях. Но достаточна ли она для этого процесса? Положительный ответ на этот вопрос означал бы завершение доказательства хемиосмотической гипотезы.
Предсказание Митчела состояло в том, что искусственно созданные АТ и ДрН могут поддерживать синтез АТР в отсутствие
St.5. Образование AT за счет искусственно созданной А,иН
439
переноса электронов по дыхательной или фотосивтетической ре-докс-цепям.
Первое наблюдение, свидетельствовавшее о справедливости этого постулата, было сделано еще в 1966 г. Ягендорфом и Юрай-бом [766], описавшими «темновой» синтез АТР при переносе хлоропластов из кислой среды в щелочную, что имитировало генерацию АрН на свету. Дальнейшие исследования подтвердили это наблюдение и расширили круг объектов, на которых удается продемонстрировать подобный феномен. Было показано, что не только хлоропласты, но и митохондрии, бактерии и протеолипосомы синтезируют АТР на искусственно созданных АрН и A F {см. обзор: [1399]).
9.6. Бактериородопсин и химерные протеолипосомы
Логически рассуждая, опыты, описанные выше, сами по себе представляются достаточными для заключения о справедливости хемиосмотической гипотезы. Однако инерция мышления была •столь велика, что позиция Митчела и его сторонников все еще оставалась далекой от всеобщего признания вплоть до середины 1970-х годов. От автора концепции, первоначально казавшейся фантастичной, ожидали предсказаний все новых и новых чудес. Оппоненты постоянно атаковали каждый вновь полученный ар-тумент, свидетельствующий о предсказательной силе гипотезы, вновь и вновь пытались объяснить энергетическое сопряжение в рамках если не химической гипотезы, то так называемой кон-формационной схемы или концепции Уильямса. Они говорили, что интактные мембраны слишком сложны, а реконструированные — слишком артефактны. Опыты с искусственно созданной AjIH критиковали в связи с небольшими абсолютными количествами образованного АТР (что было в общем-то понятно, если учесть малый внутренний объем митохондрий, бактерий и т. п.).
Последней каплей, перевесившей чашу весов в пользу Митчела, явились опыты с бактериородопсином. В 1971 г. Остерхельт, Блаурок и Стокениус [266, 1126] описали новый белок бактериородопсин, ответственный за утилизацию световой энергии гало-фильными бактериями. В 1973 г. Остерхельт и Стокениус [1127] показали светозависимый выброс ионов Н+ из клеток Н. halobium. Эффект был опосредован бактериородопсином и снимался разобщителями.
