Энергетика биологических мембран - Скулачев В.П.
ISBN 5-02-004027-4
Скачать (прямая ссылка):
В 1966 г. Ленинджер и соавт. [257] обнаружили снижение электрического сопротивления плоских искусственных фосфоли-пидных мембран динитрофенолом. В 1967 г. наша группа совместно с Е. А. Либерманом и его коллегами [1423, 1424] провела сравнение активности целой группы разобщителей в природной и модельной системах, а именно в митохондриях и плоских фос-фолипидных мебранах. Было установлено, что ряды активностей испытанных соединений как разобщителей и протонофоров совпадают. Мы сформулировали правило, что любое вещество, повышающее Непроводимость искусственной мембраны, должно обладать разобщающей активностью. Используя этот подход, мы описали целый ряд новых веществ-разобщителей.
436
9. Исторический очерк исследований по энергетике биомембран
В 1967 г. Чэппелл и Хаархофф [368] нашли, что мембрана липосом становится проницаемой для ионов водорода в присутствии одного из разобщителей. Митчел показал, что это имеет место и в случае митохондриальной мембраны [1046]. Впоследствии упомянутые выше результаты были подтверждены в опытах на интактных митохондриях из разных источников, хлоропластах, бактериях, их фрагментах и протеолипосомах (см. обзоры: [126, 1013]).
9.3. AjuH на природных мембранах
В 1966—1969 гг. Митчел и Мойл предприняли систематическое исследование ряда сопрягающих мембран (митохондрии и бактерии) с целью обнаружения на них A*F и АрН [1046, 1058, 1059, 1061, 1047, 1062]. В частности, было показано, что включение дыхания добавкой 02 к анаэробной суспензии митохондрий или бактерий, инкубируемых с валиномицином, вызывает чувствительное к разобщителю увеличение [Н+]наруж и уменьшение [К+]иаруж- Авторы интерпретировали этот факт как указание в пользу генерации соответственно АрН и А^, предполагая, что внутренность митохондрий и бактерий при дыхании становится более щелочной и отрицательной в сравнении с инкубационной •средой.
Валиномицин впервые был применен в биоэнергетике Муром и Прессманом в 1964 г. [1071]. Авторы описали валиномицинза-висимое поглощение ионов К+ энергизованными митохондриями. Было сделано предположение, что в митохондриях существует белковый рецептор, ответственный за эффект валиномицина.
Однако уже в 1966—1967 гг. удалось показать повышение К+-проводимости чисто липидных модельных мембран — плоских (Лев и Бужинский [77] и Мюллер и Рудин [1080]) и липо-сомальных (Чэппелл и Хаархофф [368]). Это свидетельствовало в пользу правомочности использования валиномицина как калиевого ионофора для измерения AXF в цитированных выше опытах Митчела и Мойл. Тем не менее адвокаты химической схемы прэд-положили, что валиномицин «прошивает» внутримембранный гидрофобный барьер, который в отсутствие ионофора препятствует доступу ионов К+ к гипотетической К+—АТРазе. К+—АТРаза действительно была впоследствии обнаружена у Е. coli, растущих при низкой [К+]наругк, а также в некоторых особых случаях во внешней мембране животной клетки (см. разделы 4.5.3 и 7.7).
Чтобы исключить такую возможность, в 1969—1970 гг. группа Е. А. Либермана и наша лаборатория сделали попытку заменить ион К+ на какие-либо синтетические ионизированные соединения. В опытах с БЛМ было испытано множество синтетических кислот и оснований, что позволило выявить группу соединений,
9.4. ЛиН на реконструированных мембранах
437
способных проникать через искусственные мембраны в своей заряженной форме. Эти проникающие ионы инкубировали с неэнер-гизованными митохондриями. Затем митохондрии энергизовали я следили за концентрацией ионов в инкубационной смеси. Как оказалось, энергизация вызывает поглощение митохондриями катионов и выход из них анионов. Эффект зависел от гидрофобности и знака заряда иона, в то время как детали его химической структуры были несущественны. Знак заряда определял направление движения иона [935, 936].
Впоследствии метод проникающих ионов был применен для измерения А'? на бактериальных мембранах (см. обзоры: [684, 1410]). Электрохромный сдвиг пигментов фотосинтетической мембраны был использован Виттом и соавт. [1608], чтобы следить за в хлоропластах и некоторых бактериях-фотосинтетиках
[1608]. В 1970-е годы были разработаны флюоресцентные зонды на АР', подтвердившие данные, полученные нашим методом и методом Витта.
В нашей группе субмитохондриальные частицы и хроматофоры бактерий были сорбированы на мембранные фильтры, импрегниро-ванные фосфолипидами. В этой системе генерацию Д F за счет энергии дыхания, света или АТР удалось измерить вольтметром, соединенным с двумя электродами, помещенными по обе стороны фильтра [226, 876, 1405].
В нескольких лабораториях была измерена ДрН на сопрягающих мембранах. С этой целью рНнаруж определяли рН-электро-дом или непроникающим рН-индикатором. Для измерения рНвпутр применили подход, предложенный ранее в опытах с проникающими ионами, с той лишь разницей, что вместо солей сильных кислот и оснований использовали соли слабых кислот и оснований. Как направление, так и величина ДрН оказались в соответствии с предсказаниями Митчела. Отсек, при энергизации заряжающийся отрицательно, защелачивался, причем этот эффект возрастал в присутствии проникающих ионов. Общая величина Д(1Н обычно составляла порядка 150—250 мВ [126, 684].
