Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Скулачев В.П. -> "Энергетика биологических мембран" -> 17

Энергетика биологических мембран - Скулачев В.П.

Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран — М.: Наука, 1989. — 564 c.
ISBN 5-02-004027-4
Скачать (прямая ссылка): energetikabiologicheskihmembran1989.djvu
Предыдущая << 1 .. 11 12 13 14 15 16 < 17 > 18 19 20 21 22 23 .. 253 >> Следующая

Чтобы измерять сдвиги pH быстрее, чем это делает стеклянный электрод, применяют непроникающие рН-индикаторы. По изменению поглощения света индикатором (или его флюоресценции) при протонировании можно судить, например, о выделении Н+-ионов энергизованными митохондриями. Среди рН-индика-торов, отвечающих на изменение pH спектральным сдвигом, можно упомянуть n-нитрофенол и пиранин [239, 633]. Умбелли-ферон может служить примером флюоресцирующего рН-инди-катора [654, 959].
Зная величину изменения pH снаружи пузырька, мы можем рассчитать сдвиг pH в его внутреннем объеме. Для такого рас-счета необходимо измерить объем пузырька и рН-буферную емкость заключенного в нем раствора (метод см.: [1062]).
Другой способ следить за вариациями внутреннего pH связан с измерением распределения проникающих слабых кислот или оснований между средой и пузырьком. Дело в том, что защела-чивание внутренности пузырька ведет к поглощению слабой кислоты, если ее нейтральная (протонированная) форма проникает, а ионизованная (депротонированная) форма не проникает через мембрану. Соответственно закисление пузырька будет иметь следствием накопление в нем слабого основания при условии, что из двух его форм только нейтральная (непротонированная) способна пересечь мембрану.
В качестве проникающей слабой кислоты можно использовать 14С-уксусную, бензойную или салициловую кислоты [1274]. В последнем случае применяют также специальный электрод, чувствительный к салицилату. Если в ту же экспериментальную камеру поместить еще и ТФФ+-чувствительный электрод, то можно следить одновременно за AY и АрН [1355].
В тех случаях, когда для измерения АрН требуется слабое основание, можно взять [14С]-метиламин [1274]. Существует также оптический метод, позволяющий следить за накоплением проникающего слабого основания. Мембранные пузырьки, накапливающие ионы Н+, поглощают флюоресцирующее слабое осно-
2.3. Измерение быстрых процессов протонирования—депротонирования 45
вание атебрин [824]. При его аккумуляции внутри пузырька молекулы этого вещества собираются в комплексы, что сопровождается гашением флюоресценции.
Следует подчеркнуть, что атебрин нельзя использовать для измерения АрН обратного знака (защелачивание внутреннего объема). Выходя из пузырька, он разбавляется в «океане» инкубационной смеси и образования комплексов не происходит.
2.3. Измерение быстрых процессов протонирования—депротонирования
Очевидно, что любой процесс переноса ионов Н+ через мембрану складывается из поглощения Н+ с одной стороны мембраны, транслокации Н+ сквозь гидрофобный барьер и выделения Н+ на противоположной стороне мембраны. Следить за перемещением протонов или электронов внутри мембраны можно, измеряя AY (см. предыдущий раздел). Что же касается переноса Н+ из воды в мембрану и из мембраны в воду, то здесь применяют быструю регистрацию спектральных сдвигов рН-индикаторов.
Быстрые электрические и рН-измерения требуют одновременного срабатывания всех молекул АрН-генераторов в исследуемой системе. В случае светозависимых AjTH-генераторов это может достигаться применением лазерной вспышки с длительностью меньшей, чем время одного оборота генератора. Например, однократное срабатывание бактериородопсина происходит за 10 мс, причем две главные электрогенные стадии процесса занимают порядка 0,1 мс и 10 мс. Для изучения этого АрГН-гене-ратора мы применили лазер с временем вспышки порядка 30 не. Чтобы следить за кинетикой выделения и поглощения ионов Н+ бактериородопсином, мы измеряли поглощение света рН-инди-катором n-нитрофенолом в суспензии пурпурных бляшек — открытых фрагментов цитоплазматической мембраны галобактерий, содержащих бактериородопсин. Поскольку отщепление Н+ от бактериородопсина под действием света происходит на два порядка быстрее, чем последующее присоединение Н+ с другой стороны бляшки, pH-ответ на одиночную вспышку лазера выглядел как временное закисление среды, появляющееся за 0,1 мс и исчезающее за 10 мс [498]. (Подробнее см. ниже раздел 3.5.6.1.) Важный технический момент обнаружился при исследовании быстрых изменений pH. Оказалось, что при временах, короче
1 мс, скорость ответа рН-индикатора лимитируется диффузией Н+ -ионов от бактериородопсина к n-нитрофенолу. Как показали опыты, этот процесс резко ускоряется в присутствии рН-буфера. Поэтому инкубационная смесь при измерении pH-ответов бактериородопсина была дополнена небольшим количеством (4 мМ) рН-буфера — морфолиноэтансульфоната [498].
46
2. Специфические методы мембранной биоэнергетики
Проблема измерений кинетики транспорта Н+ резко усложняется в случае AjIH-генераторов, использующих химическую энергию, а не свет. Чтобы быстро включить такой генератор, требуется светочувствительное вещество, служащее либо предшественником субстрата (или активатора), либо ингибитором исследуемого фермента. Применение такого подхода ограничивается требованием, чтобы процесс превращения предшественника в субстрат под действием света сам по себе не сопровождался изменением pH. Это ограничение отсутствует, если измеряется не выделение или поглощение Н+, a AY.
Предыдущая << 1 .. 11 12 13 14 15 16 < 17 > 18 19 20 21 22 23 .. 253 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed