Энергетика биологических мембран - Скулачев В.П.
ISBN 5-02-004027-4
Скачать (прямая ссылка):
2.1.3.4. Флюоресцирующие проникающие ионы:
наблюдение за A'F в отдельной клетке и органелле
В лаборатории Чена и др. [374, 430, 781] и независимо в нашей группе [95, 1359, 15161] был разработан метод наблюдения за образованием AY в отдельной клетке или митохондрии. С этой целью применили флюоресцирующие производные проникающих синтетических катионов, а именно этилродамин и метил-родамин (другое название родамин 123) (рис. 16).
Рис. 16. Алкилирован-ный родамин — флюоресцирующий проникающий катион
R — может быть метилом или этилом
Принцип подхода состоит в следующем. При энергизации митохондрии или бактерии аккумулируют любой проникающий катион, поскольку их внутренность заряжается отрицательно. Если катион способен флюоресцировать, можно наблюдать флюоресценцию отдельной бактериальной клетки или митохондрии прд микроскопом.
Опыты, проведенные в нашей группе И. И. Севериной [95], показали, что катионные формы упомянутых выше производных родамина пересекают черную мембрану, генерируя диффузионный потенциал. Чен и соавт. в США [374, 430, 781] и И. А. Воробьев и Д. Б. Зоров в нашей лаборатории [1561] показали, что алкилродамины вызывают прижизненную окраску митохондрии в различных типах животных клеток. Л. Е. Бакеева и соавт. [4] продемонстрировали, что в клетках культуры человеческих
42
2. Специфические методы мембранной биоэнергетики
фибробластов, прокрашенных этилродамином, светятся только митохондрии, причем в определенных условиях, когда митохондрии имеют нитчатую форму, можно наблюдать свечение всех без исключения митохондрий в исследуемом образце. Этот последний результат был получен путем сопоставления фотографий одной и той же клетки под флюоресцентным и электронным микроскопами.
Флюоресцентный метод создает уникальную возможность наблюдать непосредственно в живой клетке за энергизацией тонких нитчатых митохондрий, не видимых в световой микроскоп любым другим способом. Это и не удивительно, так как флюоресцирующая частица будет видна как источник света даже в том случае, если ее размер меньше длины волны видимого света. Так, ночью мы видим свет звезд, хотя они слишком мелки с точки зрения земного наблюдателя, чтобы быть видимыми днем как тела, поглощающие свет.
Используя этот метод, нам удалось доказать кабельную функцию нитчатых митохондрий, способных передавать электроэнергию из конца в конец клетки [4, 55] (подробнее см. раздел 6.2.4.4).
В других опытах нашей группы этилродамин был использован чтобы следить за кинетикой образования и рассеяния ДЧ*1 в отдельной клетке трихома цианобактерий. Флюоресценцию измеряли микрофлюориметром. Результаты типичного опыта показаны на рис. 17. Генерацию ДЧ*1 на цитоплазматической мембране клетки цианобактерии вызывали включением света, запускающего фотосинтез. Начальное обратимое снижение ДЧ*1 обусловлено передачей вдоль трихома сигнала фототаксиса, зависящего от Са2+ [668]. Дальнейший устойчивый уровень Д? поддерживается энергией света, поглощенного фотосинтетическими Др;Н-генера-торами.
2.1.3.5. Каротиноидный сдвиг
У некоторых фотосинтезирующих бактерий и хлоропластов образование ДЧ*1 вызывает небольшой сдвиг максимума поглощения каротиноидов, а также хлорофилла [17, 45, 46, 531, 694, 764, 765, 792, 793, 1321, 1548, 1620]. Этот электрохромный эффект может быть показан как при естественной (энзиматической), так и при искусственной генерации ДЧ*1. Преимущество метода состоит в том, что он позволяет регистрировать изменения ДЧ*1 способом, не требующим никаких внешних воздействий на исследуемую систему. Однако метод имеет и свои весьма серьезные ограничения. Измеряя электрохромный сдвиг, мы не можем различать трансмембранное поле, направленное поперек мембраны, от локальных полей, электрический вектор которых может быть наклонен под любым углом к плоскости мембраны. Например, было показано, что изменения поверхностного потенциала вызы-
2.2. Измерение Л pH
43
флюориметром
В качестве красителя использован этилродамин (по: Броун и соавт.[30])
вают каротиноидный сдвиг [62, 760]. Кроме того, этот метод не применим к протеолипосомам и громадному большинству природных мембран.
Сравнение каротиноидного метода с прямым измерением AY и методом проникающих ионов можно найти соответственно в работах [486] и [384].
Что касается прочих методов измерения AY, то они либо весьма косвенны, либо применимы только к очень узкому кругу объектов.
2.2. Измерение АрН
Если «протонная» энергопреобразующая мембрана проницаема Для любого иона кроме Н+, то первичная форма А]Ш (электрический потенциал) превращается в разность pH между двумя объемами, разделенными мембраной. Простейший способ следить за АрН состоит в измерении концентрации водородных ионов снаружи клеток, органелл или протеолипосом.
Если, скажем, Ар^Н-генераторы^митохондрий экспортируют Н+ из матрикса в инкубационную смесь, то увеличение концент-
44
2. Специфические методы мембранной биоэнергетики
рации Н+ в этой смеси может быть зарегистрировано стеклянным рН-электродом при условии, что концентрация рН-буфера в среде низкая [1274]. В таком случае, как было найдено, митохондрии выделяют Н+ в количестве, достаточном для измеримого сдвига pH в инкубационной среде, несмотря на сильное разбавление выделяющихся ионов, происходящее из-за того, что объем митохондриального матрикса составляет обычно не более 0,1% общего объема смеси. Такое измерение оказывается возможным благодаря большой буферной емкости матрикса. Подобные соотношения характерны и для бактерий. В случае протеолипосом приходится добавлять непроникающий рН-буфер в смесь для их реконструкции. Затем внешний буфер отмывают переосаждением протеолипосом в среде без буфера.
