Энергетика биологических мембран - Скулачев В.П.
ISBN 5-02-004027-4
Скачать (прямая ссылка):
7.1. Генераторы ЛиIVа
381
портом Na+:
СоА—СО—CH(CHS)—COO- + 2Na+H5.Tp + Н+ СоА-СО-СН2-СН3+
+ C02 + 2N<apyjK. (56)
Фермент, как и в предыдущих случаях, содержит биотин и требует Na+ для декарбоксилирования. Субклеточные пузырьки V. alcalensis переносят два иона Na+ на каждую молекулу де-карбоксилированного субстрата [722]. Декарбоксилаза была очищена и встроена в протеолипосомы. Декарбоксилирование создавало тридцатикратный градиент Na+ между внутренностью протеолипосом и средой. Протонофоры ускоряли вход ионов Na+в протеолипосомы, по-видимому, сбрасывая AY, которая образовывалась-при унипорте Na+ [722, 1266].
Встроив в одну и ту же протеолипосому декарбоксилазу ме-тилмалонил-СоА из V. alcalensis и оксалоацетатдекарбоксилазу из К. aerogenes, Димрот и Хильперт [473] показали, что декарбоксилирование метилмалонил-СоА обращает реакцию декарбоксилирования оксалоацетата. Это означает, что химическая работа может в принципе совершаться за счет AjINa, образуемой Na+-транспортирующей декарбоксилазой:
метялмалонял-СоА —» проштонял-СоА -f- С02 -f- AfiNa, (57)
Др-Na -j- пируват -j- С02 —» оксалоацетат. (58)
7.1.2. ^^транспортирующая дыхательная цепь
В 1977 г. Унемото и соавт. описали активацию ионами Na+ NADH-оксидазы морской щелочеустойчивой Vibrio alginolyticus и умеренно галофильной Vibrio costicola. Другие катионы были неэффективны. В тех же условиях NADH-оксидаза Е. coli не требовала Na+ для достижения максимальной активности [1538]. Дальнейшие исследования той же группы выявили, что №+-зависимая стадия локализована между NADH-дегидрогеназой и менахино-ном или убихиноном, в то время как цитохромный сегмент цепи активен и без Na+ [1536].
В 1981 —1982 гг. Токуда и Унемото [1511, 1512] продемонстрировали сопряженный с дыханием экспорт Na+ из клеток V. alginolyticus. Затем авторам удалось выделить ^'‘'-транспортирующую NADH-MeHa(y6n)xHHOHpeflyKTa3y и встроить ее в протеолипосомы. Окисление NADH протеолипосомами сопровождалось накоплением в них ионов Na+. Исключение Na+ из состава среды инкубации тормозило скорость окисления NADH [1507] в 15 раз. В нативных бактериальных мембранах зависимость дыхания от Na+ была выражена слабее [1511, 1515].
Na^-транспортирующая NADH-хинонредуктаза имеет оптимум pH между 8,5 и 9,0. Она специфически тормозится ионами Ag2+, а также очень низкими концентрациями N-окиси 2-гептил-
382
7. Натриевый мир
2Q Q
Рис. 116. Гипотетический механизм \а^-транепортирующей NADH-хинон-редуктазы V. alginolyticus
Стадия, катализируемая а-субъединицей, специфически требует ионов Na+, поэтому предполагается, что она сопряжена с транспортом Na+ (по: Унемото и Хайяши [1537])
4-оксихинолина (HQNO). Окисленный (но не восстановленный) ТМФД снимает тормозящее действие HQNO [1512, 1417, 465, 194, 1510]. Ка+-независимая NADH-хинонредуктаза, сосуществующая с Na+-3aBHCHMoft, оказалась устойчивой к тем же концентрациям HQNO. В то же время детергент липонокс тормозил Ка+-независимый фермент и не влиял на ^+-завиСимый [1514].
По данным Унемото и Хайяши [697, 1537], Na+-TpaHCnopTH-рующая NADH-хинонредуктаза состоит из двух мономеров, составленных из трех субъединиц: а (52 кДа), Р (46 кДа) и у (32 кДа). Соответствующие гены находятся, по-видимому, в большей из двух плазмид, обнаруженных у V. alginolyticus. а-Субъединица содержит FMN, а Р-субъединица — FAD. В отсутствие CoQ NADH восстанавливает FAD, но не FMN. Очищенная сс-субъ-единица сама по себе не обладает какой-либо ферментативной активностью, но при реконструкции с очищенными Р- и 7-субъединицами она дает комплекс, восстанавливающий CoQ до CoQH2 посредством NADH. Максимальная активность наблюдается при соотношении FAD : FMN около 1. Без у-субъединицы комплекс неактивен. Авторы предположили (рис. 11б), что Р-субъединица катализирует перенос восстановительных эквивалентов с NADH на FAD и далее на CoQ с образованием CoQ" (NADH-дегидроге-назная часть комплекса), а а- и Р-субъединицы ответственны за дисмутацию двух CoQ" с образованием CoQH2 и CoQ. Именно эта последняя реакция зависит от Na+.
По данным Токуды и Унемото [1512], транспорт Na+ NADH-хинонредуктазой носит электрогенный характер, что было установлено в опытах на целых клетках, поглощавших катионы тетра-фенилфосфония или (в присутствии протонофора) ионы Н+ в условиях, когда дыхание откачивало из цитоплазмы ионы Na+. В согласии с этими данными И. А. Смирнова в нашей группе [465, 1417] показала, что Na+ необходим для генерации A^F
7.1. Генераторы AuN'a
38J
в вывернутых субклеточных пузырьках V. alginolyticus, окисляющих добавленный NADH (AY измеряли по поглощению аниона фенилдикарбоундекаборана). Образование AY полностью блокировалось посредством HQNO или грамицидина А. ХКФ и мо-ненсин, добавленные порознь, не смогли предотвратить образова ние AY, в то время как вместе они сильно снижали AY. Окисление NADH без Na+ происходило с меньшей скоростью и без образования AY.
Как в интактных клетках, так и в протеолипосомах перенос Na+, сопряженный с дыханием, происходил против ATINa [1507, 1512].
Было показано, что рост V. alginolyticus при щелочных pH гораздо более устойчив к действию протонофора ХКФ, чем рост Е. coli. При pH 8,5 вибрионы поддерживали градиенты Na+, К+ и Н+, несмотря на присутствие ХКФ [1513]. Был выделен штамм V. alginolyticus, не имеющий Na'''-транспортирующей NADH-хинонредуктазы. Он оказался чувствительным к ХКФ [1514].
