Энергетика биологических мембран - Скулачев В.П.
ISBN 5-02-004027-4
Скачать (прямая ссылка):
V — вольтметр, Е — электрод (по: Либерман и соавт. [936])
лами. В результате концентрация катионов в отсеке с митохондриями снижалась, что вызывало перемещение катионов через черную мембрану из того отсека, где митохондрий не было. Диффузионный потенциал, возникающий вследствие этого на черной мембране, регистрировали электродами, погруженными в оба отсека.
Описанный метод был впоследствии усовершенствован в нашей группе [496, 1404], когда нестабильную черную мембрану заменили миллипоровым фильтром, пропитанным декановым раствором фосфолипидов (рис. 15). Недавно были изготовлены ионоселективные электроды, чувствительные к ТФФ+ [812, 48] и ТФБ" [819]. Это еще более упростило процедуру измерения А?.
Когда стали доступны радиоактивные проникающие ионы, оказалось возможным определять Д^Р по включению метки, скажем, во фракцию митохондрий [1276].
В течение последнего десятилетия метод проникающих ионов был применен для обнаружения ДТ во многих работах на митохондриях, бактериях, хроматофорах, тилакоидах и их частицах, а также других природных и реконструированных системах. Такая универсальность неудивительна, так как основное требование к объекту исследования сводится к наличию участков фос-фолипидного бислоя в исследуемой мембране. Это требование всегда выполняется в случае как природных, так и модельных мембранных образований.
Сложности возникают обычно при попытках применить метод проникающих ионов для точного измерения величины Д?, образуемой Д^Ш-генераторами. Здесь следует иметь в виду, что гидро-фобность используемых ионов, позволяющая им пересекать мембрану, предопределяет большое сродство этих ионов к мембране.
40
2. Специфические методы мембранной биоэнергетики
Поэтому проникающий катион не только аккумулируется, скажем, внутри митохондрий, но также насыщает ту сторону мембраны, которая омывается внутримитохондриальным раствором. В результате количественный аспект метода оказывается не столь простым, как в случае ионов К+, которые в присутствии вали-номицина электрофоретически перемещаются из инкубационной среды во внутримитохондриальный раствор. И тем не менее метод синтетических ионов вытеснил хронологически предшествовавший ему калиевый метод. Главной причиной этого явилось то обстоятельство, что применение синтетических ионов позволяет преодолеть главную трудность, сопряженную с использованием природных ионов, которые могут вовлекаться в процессы иные, чем трансмембранный электрофорез. Кроме того, метод синтетических ионов отличается намного большей чувствительностью, чем калиевый.
В принципе, сродство каких-либо компонентов мембраны к гидрофобным ионам может меняться при энергизации. Если это имеет место, распределение ионов будет зависеть от AY более сложным образом, чем то следует из уравнения Нернста. Чтобы быть уверенным, что такого рода эффект не изменил знак ответа синтетических ионов, следует измерить другую составляющую AjIH, а именно АрН. При этом предсказание состоит в том, что отсек, аккумулирующий синтетические катионы, например внутренний объем митохондрий, становится щелочнее в условиях, когда происходит транспорт катионов. (Такие соотношения должны иметь место потому, что аккумуляция катиона вызвана работой AjIH-генераторов, откачивающих Н+ из митохондрий в инкубационную среду.) Если данное требование выполняется, можно быть вполне уверенным, что снижение концентрации синтетического иона в среде отражает появление AY.
Что касается абсолютного значения AY, то для его расчета следует в тех же условиях опыта применить также и какой-либо другой метод, например калиевый. Если оба метода дадут совпадающие результаты, то зто сильно повысит надежность измерения, поскольку ограничения двух методов совершенно различны.
Иногда сродство мембраны к гидрофобным ионам меняется AY-независимым образом при включении исследуемого энергодающего процесса, например дыхания [438]. Этот эффект можно легко обнаружить, поскольку он должен быть нечувствителен к агентам, специфически снижающим AY, таким, как валино-мицин в присутствии К+.
В следующих особых случаях метод синтетических ионов оказывается неприменимым.
1. Синтетический ион сильно тормозит исследуемый AjIH-генератор; это явление встречается сравнительно редко, так как в силу высокой чувствительности метода можно использовать низкие концентрации иона.
2;1. Измерение мембранного потенциала (АЧГ)
41
2. Ион метаболизируется или взаимодействует с каким-либо из переносчиков, присутствующих в клетке либо органелле. Так, было показано, что ТФБ~ может служить донором электронов для фотосистемы II в хлоропластах. У одного из видов дрожжей трифенилметилфосфоний переносится системой транспорта тиамина [213, 227]. Имеются косвенные указания на энергозависимый выброс этого катиона из клеток Acinebacter calcoaceticus и Е. coli [1030].
3. Объект исследования содержит две сопрягающие мембраны, генерирующие AY противоположного знака. Именно так обстоит дело у некоторых фотосинтезирующих бактерий, содержащих суспендированные в цитозоле хроматофоры. В этом случае как цитоплазматическая мембрана, так и мембрана хроматофора несут AY со знаком минус в цитозоле.
