Энергетика биологических мембран - Скулачев В.П.
ISBN 5-02-004027-4
Скачать (прямая ссылка):
Другая трудность состоит в том, что бактерии и органеллы могут располагать АТРазными механизмами аккумуляции ионов К+ . К+-транспортирующая АТРаза была обнаружена, например, в клетках Е. coli, выращенных в среде с очень низкой [К+] (см. ниже раздел 7.7).
Еще одно ограничение метода, использованного Митчелом,— это то, что его нельзя применить к мембранным образованиям, внутренность которых заряжается не отрицательно (как в случае митохондрий и бактерий), а положительно. Таковы тилакоиды хлоропластов, бактериальные хроматофоры, а также «вывернутые» субмитохондриальные и суббактериальные пузырьки. При включении AjIH-генераторов все они электрофоретически выбрасывают К+ из своего внутреннего объема наружу, где К+ сильно разбавляется инкубационной средой, объем которой обычно превосходит более чем в 1000 раз суммарный объем исследуемых мембранных пузырьков в пробе.
2.1. Измерение мембранного потенциала (А’ЧГ)
37
2.1.3.3. Синтетические проникающие ионы
Трудности, перечисленные в предшествующем разделе, можно обойти, если использовать синтетические проникающие ионы вместо природного К+ или близкого к нему по свойствам Rb+. При поиске таких ионов главная проблема сводилась к тому, чтобы преодолеть непроницаемость энергопреобразующих мембран для гидратированных ионизованных соединений. Мембраны этого типа пропускают только очень узкий круг природных ионов, для которых есть специальные переносчики, или каналы. Чужеродные ионы не имеют своих переносчиков, и потому гидрофобная сердцевина мембраны служит для них практически непреодолимым барьером.
Чтобы решить вопрос, требовалось найти ионы с низкой степенью гидратации и потому с высокой растворимостью в жиру. Как показало исследование, проведенное лабораториями Е. А. Либермана и нашей [82, 208, 648, 758, 935, 936], такие свойства присущи синтетическим ионам, заряд которых делокализо-ван по всей ионизованной молекуле или экранирован гидрофобными заместителями.
Чтобы отобрать такие вещества, большой круг соединений был проверен в опытах с черными мембранами. Предполагалось, что добавление соли проникающего катиона (Х+) и непроникающего аниона (например, С1~) в один из отсеков, разделенных мембраной, должно создавать диффузионный электрический потенциал (отрицательное заряжение отсека, содержащего XG1). Этот эффект должен возникать вследствие движения Х+ из отсека, куда он добавлен, в противоположный отсек. В случае соли непроникающего катиона и проникающего аниона можно ожидать появления потенциала обратного знака.
В опытах, поставленных по этому плану, удалось обнаружить несколько веществ, отвечающих приведенным выше требованиям. Формулы некоторых из них показаны на рис. 14.
Наиболее наглядным оказалось сравнение тетрафенилфосфо-ния и тетрафенилбората, соединений, отличающихся только ионизованным атомом (Р+ в первом и В- во втором случае). Оба иона генерировали разность диффузионных потенциалов, направление которой свидетельствовало, что производное Р+ — проникающий катион, а производное В- — проникающий анион.
Особенно высокой была проницаемость черной мембраны для анионов фенилдикарбаундекабората. Именно это вещество было затем использовано при изучении различных природных мембранных систем и протеолипосом. Кроме того, было найдено, что фе-нилдикарбаундекаборат и ТФБ- сильно повышают проницаемость бислойных мембран для синтетических катионов.
Отобрав проникающие ионы в опытах с черными мембранами, мы затем испытали их на митохондриях и вывернутых субмито-
38
2. Специфические методы мембранной биоэнергетики
1
;б)
СИ,
I©
Н,С—N—СНЧ
СИ,
©
XzmzzCT
6\ /Ъ
iVv/4
V/
в
2
СП,
(СН„),
I©
g3—N—(СН,)з-(СИ„),
I ?
сн3
6
Рис. 14. Синтетические проникающие ионы
1 — ТФБ+; 2 — фенилдикарбаундекаборат; з — тринитрофенол-анион; 4 — N.N-дифе-нил, N.N-диметиламмоний; 5 — ТФМФ; в — тетрабутиламмоний
хондриальных пузырьках, имеющих противоположную митохондриям ориентацию мембраны. Можно было надеяться, что синтетические проникающие ионы будут диффундировать сквозь те участки митохондриальной мембраны, которые представляют собой фосфолипидный бислой, аналогичный черной мембране. В этом случае ионы должны были бы распределяться между, скажем, митохондрией и средой в соответствии с AY, генерируемой этой органеллой или ее вывернутыми частицами. Другими словами, катионы должны были накапливаться в митохондриях, а анионы — в вывернутых частицах. Именно такие соотношения и были обнаружены в опытах [208, 648, 936].
Чтобы следить за концентрацией проникающих ионов в инкубационной среде, Либерман и соавт. [936] предложили использовать ту же самую черную мембрану, которая была применена для поиска проникающих ионов. Митохондрии добавляли в один из двух отсеков тефлоновой ячейки, разделенной перегородкой с отверстием, затянутым черной мембраной. В оба отсека вносили проникающий катион. Энергизация митохондрий, например при включении дыхания, вызывала поглощение катиона органел-
2.1. Измерение мембранного потенциала (АЧГ)
39
Рис. 15. Устройство для измерения мембранного потенциала в митохондриях посредством синтетического проникающего иона (С+)
