Энергетика биологических мембран - Скулачев В.П.
ISBN 5-02-004027-4
Скачать (прямая ссылка):
2 В. П, Скулачев
34
2. Специфические методы мембранной биоэнергетики
1 — излучаемый Д|Ш -генератор; 2,3, 4 — другие мембранные белки; 5 — фос-фолипид
Сказанное позволяет заключить, что предложенный метод достаточно универсален для изучения электрогенных биологических систем.
На рис. 13 дана общая схема изучения ЛуШ-генерирующих устройств клетки, включающая их очистку и самосборку и завершающаяся прямым измерением преобразования ими световой или химической энергии в электрическую форму.
2.1.3. Измерение A‘F в интактных клетках и органеллах
2.1.3.1. Микроэлектродный метод
Описанный выше подход, связанный с очисткой и самосборкой генераторов и потребителей ДрГН, позволяет ответить на два вопроса: способен ли данный фермент генерировать A^F и (в случае положительного ответа) каковы временные характеристики отдельных стадий этого процесса превращения энергии. Однако
2.1. Измерение мембранного потенциала (ДЧГ)
35
список задач, касающихся изучения ДрГН-генераторов, не исчерпывается названными проблемами. Необходимо также понять, какое место в системе преобразования энергии клеткой занимают исследуемые ДЩ1-генераторы, как регулируется их активность, не нарушаются ли они при патологиях, а если такое нарушение происходит, то как можно его исправить, и т. д.
Для анализа всех зтих проблем приходится исследовать не протеолипосомы, а интактные органеллы, клетки, органы и даже организмы. Кроме того, всегда желательно любые работы с модельными системами, такими, как протеолипосомы, сопровождать опытами на природных объектах, чтобы уменьшить риск артефактов.
К сожалению, прямое измерение электродами AY на природных мембранах возможно только в очень ограниченном числе случаев. Электрод удается ввести лишь в крупные эукариотические клетки с тем, чтобы измерить AY на их внешней мембране. В то же время бактерии, митохондрии и хлоропласты, т. е. объекты, наиболее интересные с точки зрения биоэнергетики, слишком малы для применения микроэлектродного метода. По образному выражению Ракера [1225], ввести микроэлектрод в митохондрию — это все равно как попытаться засунуть бейсбольную биту в кошку. Сравнительные размеры очень тонкого микроэлектрода и протеолипосомы диаметром 20 мкм были проиллюстрированы выше на рис. 12. Как правило, диаметр бактерии или органеллы существенно меньше 20 мкм, так что введение микроэлектрода всегда сопряжено с сильными повреждениями исследуемого объекта и разрядкой AY из-за короткого замыкания в месте прокола мембраны. Сопротивление энергопреобразующих мембран обычно очень высоко (гораздо выше, чем внешней мембраны животной клетки), и даже небольшое увеличение проводимости ведет к практически полному рассеянию AY. Именно этот эффект преследовал, по-видимому, Тедески [1499], который в течение многих лет безуспешно пытался измерить AY электродом, введенным в митохондрию.
Однако применительно к другим системам в литературе можно найти несколько указаний на положительный результат измерения AY микроэлектродами.
Хронологически первым среди них было сообщение А. А. Булычева и соавт. из МГУ [331, 332]. Авторы ввели микроэлектрод в гигантский хлоропласт в клетке эукариотической водоросли и измерили светозависимую генерацию AY. Позднее Хэдер [668] провел аналогичные измерения на крупных многоклеточных цианобактериях. В лаборатории Слеймзна зависящая от дыхания AY была измерена микроэлектродом, введенным в клетку штамма Е. coli, который отличался сравнительно большим диаметром, чем дикий тип той же бактерии. В дальнейшем, однако, у авторов возникли трудности с воспроизведением этого эксперимента.
36
2. Специфические методы мембранной биоэнергетики
Ни одна из упомянутых выше систем не стала общепринятой моделью, и только работа А. А. Булычева и соавт. была воспроизведена в другой лаборатории [1562].
Коллодиевая пленка не может быть использована в опытах с интактными бактериями, митохондриями и хлоропластами, так как во всех этих случаях прямому контакту с внутренней мембраной мешает клеточная стенка или внешняя мембрана клетки (органеллы). Эта трудность, по-видимому, присуща и методу «пэт-ча», когда микроэлектрод прикасается к исследуемой мембране, не протыкая ее.
2.1.3.2. Природные проникающие ионы и ионофоры
Пытаясь проверить постулат хемиосмотической теории о генерации АЧ*1 на сопрягающих мембранах, Митчел измерял распределение ионов К+ между инкубационной средой и митохондриями [1047, 1062] или бактериями [1330]. Для повышения калиевой проницаемости мембран добавлялся ионофор валиномицин. Электрофоретическое поглощение ионов К+ митохондриями или бактериями регистрировалось по уменьшению в среде концентрации К+, измеряемой чувствительным к К+ стеклянным электродом. В некоторых более поздних работах ион К+ был заменен ионом радиоактивного рубидия. Аккумуляцию последнего измеряли по включению радиоактивности в митохондрии (бактерии) [1274].
Недостаток обоих этих методов состоит прежде всего в том, что и митохондриальная и бактериальная мембраны содержат К+/ Н+-антипортеры. Такие системы, обменивающие К+ (или Rb+) на Н+, были постулированы Митчелом [1045, 1046], а затем описаны рядом авторов (см.: [249, 1330]). Они могут маскировать транспорт K+(Rb+) под действием электрического поля. Ситуация дополнительно усложняется, тем, что А? активирует К+/Н+-антипорт [249].
