Энергетика биологических мембран - Скулачев В.П.
ISBN 5-02-004027-4
Скачать (прямая ссылка):
Дальнейшее исследование этого эффекта показало, что степень разобщения достигает максимума уже через 15 мин после помещения животного на холод. Разобщение в мышечных митохондриях могло быть продемонстрировано не только у птиц, но и у млекопитающих, а именно у мышей [136].
302
5. Потребители ДцН
Следующая проблема состояла в том, происходит ли разобщение in vivo или оно есть следствие повреждения митохондрий при выделении и инкубации. Но сути дела, этот ключевой вопрос всегда возникает, когда в опытах на митохондриях in vitro пытаются проследить влияние факторов, действовавших in vivo. Ниже мы рассмотрим, как была решена подобная проблема применительно к холодовому разобщению в мышцах, поскольку впервые это удалось сделать как раз на данной модели.
Один из использованных подходов состоял в измерении концентрации метаболитов непосредственно в мышечной ткани. Оказалось, что концентрация высокоэнергетических соединений возрастает при первом охлаждении и падает при втором [136]. Этот факт свидетельствовал по меньшей мере о том, что мышцы как-то вовлечены в исследуемый терморегуляторный ответ. Измерение дыхания in vivo выявило его стимуляцию как при первом, так и при повторном охлаждении животного. В первом случае стимуляция сменялась прогрессирующим торможением дыхания, в то время как во втором торможения не наступало [135]. Именно таких соотношений можно было ожидать, если животное, охлаждаясь впервые, не успевало в должной степени разобщить дыхание от фосфорилирования и избыточное потребление кислорода приводило к избыточному синтезу АТР и торможению дыхательной цепи по механизму протонного контроля. При втором действии холода происходило сильное разобщение, предотвращавшее накопление АТР и исчерпание ADP, так что состояние дыхательного контроля не наступало. Но если эта логика верна, то введение животному искусственного разобщителя-протонофора при первом охлаждении могло бы спасти организм от скоропостижной смерти от холода. Опыты, поставленные С. П. Масловым, подтвердили это предсказание. Инъекция 2,4-динитрофенола, который вообще-то ядовит для животных, значительно увеличивала продолжительность жизни на холоде мышей, впервые подвергнутых охлаждению [136].
Другой подход состоял в изучении in vitro систем, иных, чем изолированные митохондрии. Как показала Е. А. Мишукова [78], повторное охлаждение снижает пастеровский эффект в мышечных гомогенатах. Это наблюдение также было предсказано гипотезой
о терморегуляторном разобщении в мышце: разобщенное дыхание уже не может конкурировать с гликолизом за ADP и фосфат*
В других опытах Е. Н. Моховой и Д. Б. Зоровым [66, 94] было показано, что дыхание интактной мышцы диафрагмы крысы активируется при повторном охлаждении животных. Одновременно снижается степень стимуляции дыхания ткани динитрофенолом. Эффект, подобный охлаждению, мог быть вызван инъекцией животному норадреналина.
Дальнейшие опыты показали, что концентрация жирных кислот значительно возрастает в мышцах животных, подвергнутых
5.4. ДцН как источник энергии для образования тепла
303
За 3
Рис. 94. Возможный механизм разобщения при участии ATP/ADP-антп-портера
Предполагается, что наряду с обменом ATP4~/ADP”‘~ [реакцлп 1—4] антипортер может облегчать трансмембранное электрофоретическое перемещение анионов жирных кислот (А-). Этот второй процесс происходит таким образом, что один оборот антипортера приводит к переносу одного А- из матрикса в межмембранное пространство митохондрии [реакции 1а, 2а, За и 41, Предполагается, что Анару>к соединяется с Н+ и диффундирует обратно в матрикс в форме АН, для которой мембрана проницаема. Диффузия АН, которая может происходить независимо от антипортера, на рисунке не показана
повторному воздействию холода [78]. Было получено несколько независимых свидетельств роли свободных жирных кислот в качестве медиаторов терморегуляторного разобщения в мышцах.
1. Связывание жирных кислот при промывании митохондрий раствором предварительно обезжиренного сывороточного альбумина повышало коэффициент P/О в митохондриях из мышц охлажденных животных [78].
2. Фракция жирных кислот, выделенная из мышц охладившихся животных и добавленная к митохондриям контрольных животных, вызывала разобщение [78].
3. Е. Н. Моховой и ее коллегами в нашей группе было обнаружено, что пальмитиновая кислота в концентрации всего 1 • 10-5 М заметно стимулирует дыхание мышечных митохондрий в состоянии дыхательного контроля, причем этот эффект подавляется 5* 1СГ7 М карбоксиатрактилозидом, специфическим ингибитором ATP/ADP-антипортера (см. раздел 5.2.7.2) [5]. ADP, добавленный как с олигомицином, так и без него, также подавлял стимуляцию дыхания малыми дозами пальмитата [5].
Возможный механизм разобщения жирными кислотами, опосредованного участием ATP/ADP-антипортера, показан на рис. 94.
304
5. Потребители ДцН
Предполагается, что антипортер состоит, во-первых, из «статора», несущего «ворота» для нуклеотидов, блокирующиеся кар-боксиатрактилозидом со стороны межмембранного пространства и бонгкрековой кислотой со стороны матрикса, и, во-вторых, «ротора», ответственного за обмен АТР4- на ADP3'. Анионы жирных кислот (А-) достигают, минуя «ворота», нуклеотидсвязывающих +
