Энергетика биологических мембран - Скулачев В.П.
ISBN 5-02-004027-4
Скачать (прямая ссылка):
В принципе есть два пути избежать деления AY при прямых ее измерениях. Можно попытаться воткнуть в протеолипосому электрод либо вызвать не сорбцию, а слияние протеолипосом с плоской бислойной мембраной. Первый из подходов был опробован группой Кагавы [803], применившей особый метод получения очень крупных (до 30 мкм в диаметре) протеолипосом с Н+-АТР-синтазой. Однако даже в этом случае микроэлектрод оказался слишком велик сравнительно с протеолипосомой (рис. 12), чтобы сделать возможным аккуратное измерение AY. Другим недостатком микроэлектродов оказывается их высокое электрическое сопротивление, что принципиально не позволяет разрешать быструю кинетику генерации AY.
Слияние протеолипосом с плоской черной мембраной, имеющее результатом встраивание А|1Н-генераторов в разделяющий два макрообъема фосфолипидный бислой, должно дать теоретически идеальную систему для прямого измерения AY. В этом случае ионы Н+, транспортируемые AjlH-генератором, количественно переносятся из одного макрообъема в другой. К сожалению, стабильность черной мембраны резко снижается при встраивании в нее белков. Это вряд ли удивительно, если вспомнить, что отношение диаметра отверстия, покрытого черной мембраной, к ее толщине обычно равно 105. Поэтому любой беспорядок в упаковке фосфолипидов, неизбежно возникающий при встраивании в нее белков, резко повышает вероятность разрыва мембраны, которая, по-видимому, особенно велика в случае AjlH-генераторов.
2 Следует отметить, что аттенюатор становится некомпенсированным, если входная емкость вольтметра оказывается того же порядка, что емкость С2.
Такие соотношения возникают при сорбции протеолипосом на толстой плоской фосфолипидной мембране или миллипоровом фильтре, пропитанном фосфолипидами. В то же время коллодиевая пленка и бислойная (чер-
ная) искусственная мембрана свободны от этого дефекта. Коллодиевая пленка гораздо удобнее черной мембраны, будучи механически и электриче-
ски намного более стабильной конструкцией.
32
2. Специфические методы мембран чо'1 биоэнергетики
Рис. 11. Электронная микрофотография хроматофоров Rh. rubrum, сорбированных на поверхности раздела между декановым раствором фосфолипидов (верхний слон) и водным раствором (нижний слой)
Увеличение 2 -105 [1404]
Рис. 12. Микроэлектрод, введенный внутрь крупной протеолипосомы, иммобилизованной на поверхности полилизина Увеличение 650 (из Кагавы и соавт. [803])
Полипептидные цепи в таких белках несколько раз пересекают мембрану, вызывая множественные нарушения упаковки бислоя. Только белки со сравнительно простой функцией, такой, как образование пассивных ионных каналов или связывание с определенным лигандом (белки-рецепторы), удается воспроизводимо встроить
2.1. Измерение мембранного потенциала (ЛЧГ)
33
в черную мембрану и демонстрировать их активность. Авторы, время от времени сообщавшие о встраивании в черную мембрану Др;Н-генераторов, таких, как комплексы фотосинтетических реакционных центров, бактериородопсин или цитохромоксида-за, не в состоянии исключить весьма вероятную возможность, что исследуемые белки локализованы в протеолипосомах, прикрепленных к плоской мембране.
Следует подчеркнуть, что деление тока и напряжения в системах типа «протеолипосомы — коллодиевая пленка» в общем-то не создает каких-либо принципиальных трудностей при изучении AjlH-генераторов. Конечно, в таких случаях измеряемая AY всегда оказывается ниже той, что реально образуется генератором. Однако, как показало специальное исследование, проведенное в нашей группе [486], подобное занижение не превышает двух раз, так что AY остается на вполне измеримом уровне.Что касается временного разрешения, то оно здесь не хуже, чем при встраивании белка в черную мембрану, и много лучше, чем при использовании микроэлектродов, будучи лимитированным только электрометром. В наших опытах разрешение составляло 50 не, что значительно короче времени однократного срабатывания любого ДуЩ-генератора. Вот почему этим методом удается следить не только за валовым процессом генерации AY, но и за его отдельными этапами. Другими словами, можно регистрировать перемещение заряда (Н+ или электрона) внутри молекулы белка-генератора. Этот подход важен для понимания механизма генерации Др,Н. Он особенно плодотворен в тех системах трансформации энергии, которые могут быть очень быстро приведены в действие. Таковы светозависимые А^ГН-генераторы.
Система «протеолипосомы — коллодиевая пленка», первоначально разработанная для изучения бактериородопсина [57, 497, 1404, 1400], была затем использована при исследовании целого ряда других мембранных преобразователей энергии, таких, как бактериальные фотосинтетические центры и фотосистема I из хлоропластов [502], зрительный родопсин [61, 492]. Протеолипосомы, сорбированные на миллипоровских или тефлоновых фильтрах, были применены в опытах с цитохромоксидазой [488], Н+-АТР-синтазой [490], пирофосфатазой [73, 871], трансгидрогена-зой [60, 496]. Фактически во всех случаях без исключения, когда необходимо было измерить генерацию AY, нам удалось достичь этой цели, используя названную систему. Метод был успешно взят на вооружение в ряде других лабораторий (см., например, [270, 940, 1368, 1506]). Он оказался применимым не только к про-теолипосомам, но и к природным мембранным фрагментам, таким, как субмитохондриальные частицы [137, 876, 1190], бактериальные хроматофоры [226, 486, 502], частицы цитоплазматической мембраны бактерий [1032], фоторецепторные диски [24, 25, 492, 1364, 1365], бляшки, содержащие бактериородопсин [495, 496, 1411].
