Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Скоупс Р. -> "Методы очистки белков" -> 92

Методы очистки белков - Скоупс Р.

Скоупс Р. Методы очистки белков — М.: Мир, 1985. — 358 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiochistkibelkov1985.djvu
Предыдущая << 1 .. 86 87 88 89 90 91 < 92 > 93 94 95 96 97 98 .. 145 >> Следующая

Из-за сложности аппаратуры и относительно меньшей известности этого метода он используется довольно редко, и в литературе описано очень мало действительно успешных случаев применения препаративного изотахофореза. Однако этот метод обладает многообещающими достоинствами и в будущем, несомненно, получит более широкое распространение.
5.4. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ МЕЖДУ ЖИДКИМИ ФАЗАМИ
Этот раздел включен в книгу для полноты картины — распределение белков между различными фазами не является особенно удачным методом разделения, и в этом направлении было сделано очень мало работ. Метод противоточного распределения, весьма популярный метод в органической химии, применялся ранее к некоторым белкам, но с ограниченным успехом. Основная проблема — найти не смешивающийся с водой растворитель (или смешивающийся лишь частично), в котором белок был бы растворим и устойчив. Доступные растворители пригодны лишь для очень небольших полипептидов типа гормонов. В настоящее время имеются двухфазные системы (см. ниже), пригодные для их использования в методе противоточного распределения.
Поскольку лишь немногие белки растворимы (не говоря уж об устойчивости) в органических растворителях, распределение их между жидкими фазами a priori кажется малопригодным методом. Однако добавление в водный раствор некоторых гидрофильных полимеров может привести к разделению фаз и в отсутствие гидрофобных растворителей [149]. В частности, при растворении в воде в подходящих соотношениях декстрана и полиэтиленгликоля возникают две фазы — богатая декстраном и более плотная фаза, осаждающаяся на дно, и всплывающая кверху фаза, насыщенная полиэтиленгликолем. С большим числом полимерных компонентов можно получить большее число
236
Глава 5
фаз: была описана 18-фазная система [150]. В этих условиях смесь белков распределяется в растворе, и в зависимости от различий в растворимости индивидуальных белков может происходить относительное обогащение одной из фаз каким-либо белком. Разделение фаз осуществляется очень просто: кратковременное центрифугирование позволяет получить четкую границу между фазами, после чего их можно разделить в делительной воронке. Распределение в системе данного компонента смеси обычно не происходит по принципу «все или ничего», и потому выход этого компонента при одностадийной процедуре может быть не очень высоким. Сообщалось о распределении различных белков в трехфазной системе ПЭГ—декстран—фи-колл [151], причем было найдено, что важное значение имеет pH системы. Значительно более успешный метод, который, по-видимому, в будущем найдет более широкое применение, — это аффинное распределение. В этом случае одно ш растворенных веществ ковалентно связано с лигандом. Фаза, в которой концентрируется это вещество, затем обогащается специфическим по отношению к данному веществу ферментом. Хорошее отделение от примесей было достигнуто при очистке стероидизоме-разы путем связывания эстрадиола с полиэтиленгликолем и растворения этого конъюгата вместе с декстраном в препарате неочищенного фермента [152]. Красители цибакрон голубой F3GA и проционовый красный НЕ-ЗВ, связанные с полиэтиленгликолем, были также успешно использованы для этой цели; особенно удачной была очистка в производственном масштабе глюкозо-6-фосфатдепидрогеназы [153]. Это мягкий и быстрый метод. Хорошая степень очистки достигается, если большая часть примесей уходит в фазу, не содержащую связанного лиганда. С другой стороны, возникают проблемы, связанные с отделением фермента от растворимого комплекса полимер—лиганд, и эта методика вряд ли превосходит по степени разрешения технику аффинной адсорбции. Однако, поскольку она не связана с адсорбцией на твердой фазе, условия оказываются мягче и более пригодными для лабильных белков. В частности, ее можно использовать для разделения фракций частиц, связанных с мембранами. При этом можно применять мутные суспензии.
Одноступенчатое распределение обычно дает неудовлетворительные результаты, если только не происходит крайне неравномерного распределения компонентов между двумя фазами. Если бы можно было совместить распределение между фазами с хроматографией, то стало бы теоретически возможным разделение компонентов смеси с очень близкими коэффициентами разделения. Поначалу казалось, что жидкостно-жидкостная хроматография в этих условиях неосуществима. Однако на
Разделение в растворе
237
Фаза, обогащенная ПЭГ, остается вне гранул
Фаза, обогащенная декстранами, остается внутри гранул
Рис. 5.26, Жидкостножидкостная хроматография. Одна жидкая фаза удерживается за счет поверхностного натяжения на поверхности гранул в колонке, а другая фаза подвижна.
Белки распределяются между фазами
самом деле это не так, и ее можно осуществить, если одна из жидких фаз будет иммобилизована. Такой метод оказался успешным при разделении нуклеиновых кислот [154], и нет оснований считать, что его нельзя применить к белкам. Подходящий носитель, подобный шарикам агарозы, уравновешивают с одной из фаз (например, с богатой декстраном фазой), а другую фазу используют как буфер для пропускания ее через колонку (рис. 5.26). Поверхностное натяжение препятствует смешиванию двух компонентов. Обогащенная декстраном фаза остается внутри шариков или непосредственно у их поверхности. В такой колонке возможно простое распределение белков, однако аффинное распределение должно быть даже более эффективным. Система очень сходна с обычной аффинной хроматографией, и единственное различие между ними заключается в том, что связанный лиганд не присоединен ковалентно к твердому носителю, а сохраняет растворимую форму и удерживается между гранулами носителя.
Предыдущая << 1 .. 86 87 88 89 90 91 < 92 > 93 94 95 96 97 98 .. 145 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed