Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Разделение в растворе
233
затем диализовать его против разбавленного буфера, содержащего подвижные анионы типа хлорид-ионов. Сначала ток создается хлорид-ионами, которые движутся впереди белка. Единственные анионы, которые остаются позади, — это анионы белков, выстраивающиеся в соответствии с величинами их подвижности. В противоположном направлении ток проводят Н-трис+-ионы, которые присутствуют также в анодном буфере и потому все время возобновляются. Анионный компонент анодного буфера не имеет большого значения, хотя важно помнить, что хлорид-ион не слишком хороший анион для анода, поскольку при этом в качестве продукта электролиза образуется хлор. Предпочтительно, чтобы анионы на аноде выделяли лишь кислород (например, сульфат-, борат- или фосфат-анионы). Однако у катода анионы будут мигрировать в направлении белка, и поэтому следует выбирать такие анионы, которые имеют очень низкую подвижность. В качестве замыкающего буферного аниона используют е-аминокапроат. Фирма LKB рекомендует 0,23 М е-аминокапроат; pH доводят до 8,9 трисом. При этом значении pH только около 2% молекул е-аминокапроата имеет суммарный заряд [ЫН2(СН2)бС00-], а остальная их часть находится в цвиттерионной форме и, следовательно, не заряжена. Однако этот анион не только сам по себе имеет низкую подвижность; его эффективная подвижность является средней между его собственной подвижностью и подвижностью незаряженной формы молекулы, т. е. она в 50 раз меньше подвижности самого аниона. Таким образом, этот анион догоняет только белок, имеющий самую низкую подвижность.
Поскольку полосы всех компонентов вынуждены перемещаться с одинаковой скоростью, тогда как подвижность ы, этих компонентов различна, самопроизвольно устанавливается градиент напряжения ?,; именно благодаря этому истинная скорость (EiXUi) движения всех компонентов оказывается одинаковой. Это приводит к тому, что напряжение вдоль изотахофо-ретической колонки изменяется сложным образом, как показано на рис. 5.25. На границах между компонентами наблюдается резкое падение напряжения, и, поскольку это влияет на концентрацию протонов, промежуточные значения pH также изменяются. В теории изотахофорез осуществляется при постоянном значении pH, если в системе присутствует достаточно сильный буфер. На практике же возникает некоторый градиент pH; белки, обладающие более высокой подвижностью при начальном значении pH, движутся в область более низких значений pH и становятся менее подвижными. Таким образом, саморегулирование подвижностей обусловлено двумя эффектами: разностным градиентом напряжения и градиентом pH, вызывающим снижение подвижности наиболее подвижных компонентов. Ка-
Глава 5
Рис. 5.25. Изменение напряжения вдоль изотахофоретического канала в процессе перемещения компонентов.
кой из них более важен, зависит от условий разделения. С чистыми белками, по-видимому, более важное значение имеет градиент напряжения.
Проводимости белковых молекул настолько низки, что устойчивая граница может существовать лишь при чрезвычайно высоких потенциалах, представляющих к тому же опасность для персонала лаборатории. Чтобы избежать этого, препаративный изотахофорез белков проводят в присутствии амфолитов, которые играют роль «прокладок» (spacers), имеющих промежуточную по сравнению с белковыми компонентами подвижность. Эти «прокладки» увеличивают проводимость и способствуют образованию более устойчивых границ между компонентами. Их присутствие облегчает также создание градиента pH. Таким образом, изотахофорез белков сходен с изоэлектриче-ским фокусированием, за исключением того, что компоненты в случае изотахофореза продолжают перемещаться (и со временем выходят из колонки), причем индивидуальные компоненты никогда не достигают области, где значения pH соответствуют их изоэлектрическим точкам. Этим способом удается преодолеть три недостатка изоэлектрического фокусирования. Белок способен выходить из канала разделения и может быть собран так же, как и при простом электрофорезе. Неустойчивость белков в их изоэлектрических точках перестает быть проблемой, если сохраняется более высокое значение pH (или боле.е низкое при изменении общего направления потока). Не нужно также опасаться нерастворимости белка в изоэлектрической точке. Основной недостаток этого метода по сравнению с изоэлектрическим фокусированием заключается в том, что он обладает
Разделение в растворе
235
более низкой разрешающей способностью. Это обусловлено прежде всего тем, что теоретически возможные четкие границы между зонами нельзя сохранить по всей длине колонки вплоть до выхода из нее белковых фракций, а также тем, что амфоли-ты-прокладки не способны полностью разделить соседние белковые зоны. Изотахофорез имеет еще одно преимущество по сравнению как с обычным электрофорезом, так и с изоэлектри-ческим фокусированием — это свойственная ему большая емкость, позволяющая обрабатывать довольно значительные количества белка [148]. Кроме того, он не требует большого расхода амфолитов, которые добавляются лишь к исходной белковой смеси в количестве, превышающем по весу количество белка примерно в 2—5 раз.
