Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Скоупс Р. -> "Методы очистки белков" -> 65

Методы очистки белков - Скоупс Р.

Скоупс Р. Методы очистки белков — М.: Мир, 1985. — 358 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiochistkibelkov1985.djvu
Предыдущая << 1 .. 59 60 61 62 63 64 < 65 > 66 67 68 69 70 71 .. 145 >> Следующая

Окрашенные адсорбенты характеризуются тремя параметрами: 1) природой матрицы, 2) структурой красителя и 3) степенью модификации красителя. Рассматривая эти параметры по порядку, начнем с матрицы. Так же как и аффинные адсорбенты, она должна иметь открытую пористую структуру, для того чтобы крупные молекулы белка могли проникнуть внутрь частиц. Колонка, заполненная адсорбентом, должна иметь достаточную скорость потока. Желательно, чтобы в немодифицированном состоянии адсорбент был инертным. Хотя для специальных целей используется целый ряд различных носителей, наибольшее распространение получили гели агарозы, не имеющие каких-либо недостатков. Применяются также и декстрановые гели (сефадексы), но, для того чтобы белки легко проникали в них, они должны обладать очень рыхлой структурой. Такие гели, как сефадексы G-150 и G-200, очень тонкодисперсны и потому имеют плохие характеристики потока. Агарозы более пористы, но поскольку присоединение красителя лучше всего идет при температуре выше 40 °С, а в этих условиях агароза плавится, то для адсорбентов на основе обыкновенных гранул агарозы характерна относительно низкая степень модификации. Наибольшее применение находят агарозы, в которых ,поперечные сшивки образованы эпихлоргид-рином, 2,3-дибромпропанолом или акриламидом. Такие имеющиеся в продаже продукты, как сефарозы CL-4B и CL-6B, се-факрил S-300, ультрагель и биогель А, представляют собой материалы, пригодные для получения окрашенных адсорбентов; некоторые из них выдерживают нагревание до 100 °С.
В качестве красителей используются активные триазиновые красители, носящие разные названия; их структура не всегда

Глава 4
Q-
N
N
"O.S
Рис. 4.47. Структура проционового красного НЕ-ЗВ (реактивного красного 120), представляющего собой бифункциональный краситель. Один из триази-нилхлоридов соединяется с агарозой в процессе синтеза адсорбента, другой же может быть гидролизован.
точно известна, так как они запатентованы. Серия красителей фирмы IOI, называемых проционовыми, частично совпадает с серией красителей, выпускаемых фирмой Ciba-Geigy под названием цибакроны. Красители различаются по номерам цветовых индексов, и им присваиваются «реактивные (цветовые) номера». Так, наиболее широко используемый цибакрон голубой F3GA известен также как «проционовый голубой Н-В», «цветовой индекс 61211» и «реактивный голубой 2» (структура показана на рис. 4.46). Еще один очень распространенный краситель — это проционовый красный НЕ-ЗВ (реактивный красный 120), проявляющий наибольшую специфичность по отношению к NADP-связывающим ферментам (рис. 4.47).
Для специальных целей используются коричневые, зеленые, оранжевые, желтые и разных оттенков синие и красные красители. При таком их разнообразии вполне можно подобрать красители, проявляющие селективность в отношении каждой данной смеси ферментов. Тем не менее основные принципы адсорбции, осуществляемой благодаря гидрофобным и ионным взаимодействиям главным образом с нуклеотидсвязывающим доменом, справедливы для всех этих красителей. В настоящее время многие фирмы выпускают ,сорбенты на основе поперечно-сшитой агарозы, в высокой степени замещенной цибакроном голубым F3GA и проционовым красным НЕ-ЗВ. Кроме того, в продаже есть адсорбент голубой декстран—агароза. Набор «Matrex> включает оба указанных выше красителя, а также фталоциани-новые красители (голубой, зеленый и оранжевый).
Разделение белков путем адсорбции
Для связывания красителей непосредственно с агарозой гель обрабатывают раствором красителя при pH 10—11 (Ыа2СОз или NaOH) в присутствии соли (2% NaCl). При 30—40 °С связывание монохлортриазиновых красителей (проционовые ICI серии Н) заканчивается через 2—3 дня, однако дихлортриази-новые красители (проционовые ICI серии MX) более реакционноспособны, и реакция завершается через 1—2 ч. Большая часть избыточного красителя гидролизуется и превращается в неактивную форму [97]. Использование поперечно-сшитой агарозы позволяет нагревать раствор до более высокой температуры. Было найдено, что очень высокая степень замещения про-ционовыми Н-красителями достигается в результате двухчасовой обработки агарозы 0,2%-ным раствором красителя при 80— 90 °С с последующим добавлением свежей порции красителя в количестве 0,2 г на 100 мл и нагреванием смеси еще в течение 2 ч. Смесь оставляют на ночь для охлаждения и избыток красителя отмывают на бюхнеровской воронке большим количеством воды. Адсорбент можно хранить в солевом растворе с добавкой бактериостатических агентов, таких, как азид; перед использованием и после него адсорбент следует обработать раствором 6М мочевины — 0,5 М NaOH для удаления оставшегося слабосвязанного красителя.
Степень замещения — важный показатель при хроматографии на окрашенных сорбентах. Это справедливо и для других методов аффинной хроматографии. Если в связывании участвует не одна, а большее число молекул красителя, то этим достигается более прочная адсорбция (см. рис. 4.40). Кроме того, чем выше значение mt, тем больше оказывается а [уравнение (4.5)]. Иногда бывает так, что высокозамещенный гель связывает нужный фермент так прочно, что последующий его выход оказывается очень низким. В таком случае следует использовать менее замещенные гели, уменьшая время обработки геля красителем в ходе приготовления адсорбента. Для получения устойчивых результатов следует фиксировать степень замещения [98].
Предыдущая << 1 .. 59 60 61 62 63 64 < 65 > 66 67 68 69 70 71 .. 145 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed