Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Скоупс Р. -> "Методы очистки белков" -> 63

Методы очистки белков - Скоупс Р.

Скоупс Р. Методы очистки белков — М.: Мир, 1985. — 358 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiochistkibelkov1985.djvu
Предыдущая << 1 .. 57 58 59 60 61 62 < 63 > 64 65 66 67 68 69 .. 145 >> Следующая

К другим методам элюции относятся изменение температуры (снижение температуры ослабляет гидрофобные взаимодействия), разведение буфера, даже промывка водой (разд. 4.7) и электрофорез для удаления заряженных белков с колонки [87]. В заключение следует сказать, что аффинная адсорбционная хроматография является великолепным методом, если вся процедура уже тщательно отработана, однако подбор или создание необходимых адсорбентов может быть очень трудоемким процессом.
Сейчас имеется в продаже много готовых адсорбентов, которые можно использовать для работы с самыми разными белками. Из-за низкой емкости и высокой стоимости этих адсорбентов метод чаще применяется для очистки белков, составляющих лишь незначительную часть всех белков, присутствующих в смеси. В этом случае он может быть использован в качестве первого (и иногда единственного) этапа очистки. С другой стороны, при работе с большими количествами фермента (например, 100 мг) чаще применяют другие методы, па крайней мере в качестве предварительных этапов в процессе фракционирования, а стадия аффинной адсорбции вводится только в конце для окончательной очистки препарата. Адсорбенты можно использовать многократно при условии, что после использования их немедленно промывают (например, растворами мочевины или додецилсульфата натрия) и хранят с добав-
Разделение белков путем адсорбции
163
ками бактерицидных агентов (азид, мертиолат, хлорбутол). Однако .возникает проблема, связанная с потерей лиганда за счет нестойкости изомочевинной связи, образовавшейся при активации адсорбента бромцианом. Этого можно избежать, используя другие способы активации, приводящие к образованию более стабильной связи.
Ввиду того что существует много великолепных обзоров и монографий по аффинной хроматографии (см. в конце главы), я не останавливаюсь на этом вопросе более подробно и не перечисляю различные типы адсорбентов. Однако особый тип иммуноадсорбентов, в которых «лигандом» служит антитело к выделяемому белку, разбирается отдельно в разд. 4.7.
4.6. ХРОМАТОГРАФИЯ НА ОКРАШЕННЫХ АДСОРБЕНТАХ
Присоединив к высокомолекулярному растворимому декстра-ну краситель, известный под названием «цибакрон голубой F3GA», фирма Pharmacia Fine Chemicals получила окрашенный маркер свободного объема для проведения гель-фильтрации. Если бы был выбран другой краситель, то возможно, что окрашенные адсорбенты не получили бы такого широкого и быстрого распространения, какое наблюдается в настоящее время. Исследователи были озадачены, когда обнаружили, что при использовании декстрана голубого пируваткиназа дрожжей в процессе гель-фильтрации появляется в свободном объеме; это указывало на то, что ее молекулярная масса намного выше ожидаемой. Однако в отсутствие этого маркера фермент элюировался после свободного объема [88]. При гель-фильтрации пиру-ваткиназы сначала без маркера, а затем в его присутствии достигалась определенная степень очистки фермента, несмотря на то что маркер в конечном счете необходимо было удалять. Пируваткиназа связывалась с голубым красителем. Присоединением декстрана голубого к агарозе стандартными методами, используемыми в аффинной хроматографии, был получен новый тип адсорбента. Аналогичное поведение было замечено практически одновременно и при работе с фосфофруктокиназой из дрожжей [89]. В дальнейшем выяснилось, что и другие ферменты, особенно дегидрогеназы, обладают сродством к этому красителю, и теперь принято считать, что большинство ферментов, связывающих пуриновые нуклеотиды, проявляют сродство к цибакрону голубому F3GA. Хотя многие другие родственные красители также связываются различными ферментами, до настоящего времени в большинстве случаев используют краситель цибакрон голубой F3GA.
Специфичность адсорбентов, связанных с красителем, такова, что их можно считать аффинными адсорбентами, хотя ис-
11*
164
Глава 4
пользуемый краситель имеет мало явного сходства с истинным лигандом. Пожалуй, лучше называть их «псевдоаффинные адсорбенты». Молекулярные модели, показанные на рис. 4.45, дают представление о некотором сходстве между структурами красителя F3GA и (NAD; более важно в данном случае соответствие между структурами плоских циклов и расположением отрицательно заряженных групп. Недавно рентгеноструктурные исследования показали, что краситель присоединяется к алко-гольдегидрогеназе из печени в участке связывания NAD; при этом в структуре красителя выявляется соответствие с кольцами аденина и рибозы, но не с никотинамидом [91]. Таким образом, краситель ведет себя как аналог ADP-рибозы и присоединяется к участкам связывания AMP, IMP, АТР, NAD, NADP и GTP. Краситель обычно связывается с ферментом более прочно, чем истинный субстрат, при этом величины Ki составляют микромоли. Поэтому для связывания фермента с иммобилизованным красителем не всегда необходимы неспецифические взаимодействия. Более того, хотя исходный адсорбент называется голубым декстраном, декстрановый компонент служит лишь для связи с агарозой, являясь своего рода гигантским глобулярным удлиняющим мостиком, который имеет настолько
Предыдущая << 1 .. 57 58 59 60 61 62 < 63 > 64 65 66 67 68 69 .. 145 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed