Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
156
Глава 4
Рис. 4.40. Схема, иллюстрирующая необходимость точного пространственного расположения димерного фермента (заштрихован) на аффинном адсорбенте для специфического присоединения к нему лиганда в двух точках.
Отсюда вытекает второе допущение: соединение лиганда с одним центром связывания не всегда оказывается достаточным для получения хороших результатов и в некоторых случаях низкий процент связывания может быть обусловлен тем, что фермент должен быть расположен между близлежащими лигандами определенным образом, что обеспечивает его присоединение к последним по двум центрам связывания (рис. 4.40). Это, конечно, неприемлемо для моновалентных ферментов (один центр связывания).
В заключение следует отметить, что при аффинной адсорбционной хроматографии энергия взаимодействия между белком и носителем должна составлять по крайней мере 35 кДж-моль-1, что редко наблюдается при единичном взаимодействии белок — лиганд. Половина (и даже более) этой величины иногда приходится на неспецифические взаимодействия, обусловленные гидрофобными силами между аминокислотными остатками на поверхности белковой молекулы и удлиняющим мостиком. В этом случае аффинная элюция должна давать хорошие результаты и вполне достаточно весьма слабых специфических взаимодействий. Низкий процент связывания белка аффинным адсорбентом в некоторых случаях можно объяснить необходимостью биоспецифичного взаимодействия в двух точках (рис. 4.40), но более вероятно, что это обусловлено необходимостью еще и неспецифического связывания (помимо био-специфического). Если на взаимодействия обоих указанных типов налагаются строгие пространственные ограничения, то лишь относительно небольшое число молекул лиганда будет ориентировано надлежащим образом и сможет связаться белком (рис. 4.41).
Поскольку неспецифические взаимодействия неизбежны, интересно было бы поразмышлять о возможности намеренного их
Разделение белков путем адсорбции
157*
Рис. 4.41. Схема, иллюстрирующая необходимость точной пространственной ориентации фермента при специфическом и неспецифическом присоединении его к аффинному адсорбенту (фермент заштрихован).
Рис. 4.42. Смешанная аффинная и ионообменная адсорбция отрицательно заряженных белков.
введения либо за счет использования более гидрофобного носителя, либо путем введения заместителей, имеющих высокую плотность заряженных групп, притягивающих противоположно заряженные молекулы белка, например ДЭАЭ (рис. 4.42). Адсорбент последнего типа мог бы работать в условиях, когда фермент практически не связывается с обычным ДЭАЭ ионооб-менником (а в пределах 0,1—0,4), но должен связываться со
158
Глава 4
смешанным адсорбентом, в котором ионообменные взаимодействия дополняют специфические, так что величина а становится равной 0,99 и выше. В этом случае аффинная элюция даст хорошие результаты, и емкость адсорбента по отношению к нужному ферменту будет высокой.
Методика должна быть следующей:
1) Исходный материал адсорбируют на ДЭАЭ-целлюлозе и элюируют с нее обычным методом ионообменной хроматографии.
2) Элюированную фракцию наносят, не меняя буфера, на аффинный ДЭАЭ-адсорбент — при этом специфически связывается только нужный фермент.
3) Фермент элюируют буфером, содержащим лиганд, или буфером с более высокой ионной силой и пониженным значением pH.
Такие гипотетические смешанные адсорбенты до сих пор не получены1. Следовательно, пока эта идея остается лишь предположением. Так как многие лиганды заряжены отрицательно, .автоматически будет проявляться катионообменный эффект, и хотя предпочтительно работать с системой при таких значениях pH и ионной силы, которые позволяют избегать подобных эффектов, однако даже в идеальном случае это трудно достижимо. Например, киназа с незначительным сродством к АМР не связывается с AMP-агарозой в 0,1 М фосфатном буфере, но может связаться со смешанным катионообменником за счет отрицательного заряда АМР в более слабом буфере, таком, как 0,01 М МЭС или МОПС. Хотя при этом могут связываться и другие основные ферментные белки, это не означает, что они будут вымываться при аффинной элюции с помощью свободного АТР, используемого для элюции киназы, если только концентрация АТР не будет значительно повышать ионную силу.
Общие методы и процедуры, применяемые при аффинной адсорбционной хроматографии
В начале 70-х годов, когда на многих примерах была доказана высокая эффективность аффинной хроматографии, химика-ми-энзимологами овладели чувства, которые можно выразить двумя фразами: «Как же мы не додумались до этого раньше?» и «Теперь все прочие методы выйдут из употребления». Позже общая эйфория прошла, после того как многие исследователи потратили месяцы, а то и годы, безуспешно пытаясь подобрать
1 Фирма Bio-Rad недавно выпустила ионообменный адсорбент на основе «голубой агарозы, работающий по этому принципу.
Разделение белков путем адсорбции
159
подходящий адсорбент для своего фермента. В некоторых случаях, особенно когда фермент имеет необычный субстрат и составляет только часть общего белка, присутствующего в смеси» не возникает вопроса о целесообразности применения этого метода, если найден соответствующий адсорбент. Описаны примеры одноэтапной 1000-кратной очистки ферментов почти со 100%-ным выходом. Простота и легкость осуществления этой процедуры создали возможность выделения большего числа важных ферментов, встречающихся в малых количествах. НО' даже в сказке с хорошим концом бывает много тщетных усилий и хотя бы одна неудача. Основная проблема заключается в низкой емкости адсорбентов, хотя использование более новых методов связывания лигандов улучшает этот показатель и уменьшает неспецифическую адсорбцию (в результате специфическая емкость адсорбента по отношению к данному ферменту может снизиться еще больше). Однако, как мы видели, неспецифические взаимодействия являются неизбежным злом, если нужно адсорбировать определенный фермент; поэтому, чтобы добиться идеальных условий, необходимо методом проб и ошибок тщательно подбирать соответствующие адсорбент и бу-фер.
