Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Кр, ММ а КР, мМ а
1,0 0,02 0,003 0,80
0,3 0,С6 0,001 0,92
0,1 0,16 0,0003 0,97
0,03 0,35 0,0001 0,99
0,01 0,59
154
Глаша 4
гидрофобных взаимодействий с гексаметиленовой цепью, приводящих к адсорбции посторонних белков на мостике. Поскольку адсорбция происходит за счет гидрофобных взаимодействий,, введение в мостик гидрофильных групп (карбонильных и амидных) должно уменьшать степень связывания и делать адсорбент более специфичным по отношению к белку, для которого он предназначен. К сожалению, эти химически сложные адсорбенты часто очень слабо взаимодействуют с нужным ферментом и вообще с любыми другими соединениями [83, 84]. Как оказа-лось, гидрофобные взаимодействия являются необходимым условием связывания белка с адсорбентом. На самом деле первоначальные попытки получить аффинные адсорбенты без удлиняющих мостиков были безуспешными, вероятно, не потому,, что близость лиганда к агарозному остову приводила к стери-ческим затруднениям, а потому, что нужны были дополнительные силы связывания, которые обеспечиваются гидрофобной вставкой. Некоторые термодинамические расчеты дают представление о силе необходимых дополнительных взаимодействий.
Энергия взаимодействия выражается как AG°=—RT\nK?y и можно предположить, что она состоит из специфического взаимодействия фермента с лигандом AGql и неспецифического взаимодействия AG0#.
Если Кр составляет 0,001 мМ, то AG°=AG0l+AG°jv=34)5 кДжХ Хмоль-1.
Если Kl, специфическая константа диссоциации, составляет 0,1 мМ, то AG°l«23 кДж-моль”1 и AG°=»11,5 кДж-моль-1.
Допустив, что Ш(=0,02 мМ и р*=0,01 мМ, можно вычислить величину а: она будет равна 0,92.
Предположим, что введение свободного лиганда полностью исключает биоспецифическое взаимодействие белка с матрицей и AG°l равняется 0. Тогда величина а должна уменьшаться с 0,92 до 0 (так как AG0*, равная 11,5, — слишком незначительная величина, чтобы при этом могло происходить какое-либо заметное удерживание белка на колонке)*
Представив различные параметры в виде таблицы, получим:
Кр> мМ К и мМ а при от а в присут*
сутствии ствии сво
свободного бодного ли
лиганда ганда
0,001 0,1 0,92 0
0,001 1,0 0,92 0,02
0,001 10 0,92 0,16
0,0001 0,1 0,99 0,02
0,0001 1,0 0,99 0,16
0,0001 10 0,99 0,59
Из этих данных видно, что, поскольку неспецифические силы довольно слабы, величина Кр может быть очень низкой, даже если Kl имеет величину 10~3 и выше. Например, АМР, при-
Разделение белков путем адсорбции
155
соединенный к агарозе, прочно связывает дегидрогеназы, хотя величина Ki этих ферментов для АМР обычно лежит в пределах 1—10 мМ; неспедифические взаимодействия приблизительно той же силы обеспечивают прочное связывание фермента. Так как специфические и неспецифические силы аддитивны, константы диссоциации перемножаются. Устранение или снижение специфического связывания при введении свободного лиганда вызывает повышение величины Кр до значений, достаточных для быстрой элюции. Но если величина Kl высока, то концентрация лиганда, необходимого для эффективного замещения фермента, должна быть еще выше.
Подходящий аффинный адсорбент для гексокиназ можно получить, присоединив глюкозамин к агарозе через алкильную цепь [85]. Было установлено, что величины Ki для N-амино-ацилглюкозаминов (в свободном растворе) имеют более высокие значения, чем для самого глюкозамина, при наличии в аминоацильной цепи шести или меньшего числа атомов С, что указывает на нарушение связывания за счет ацильной цепи; однако, когда в цепи имеется восемь атомов С, величина Ki становится намного ниже, т. е. происходит какое-то взаимодействие ацильной цепи с ферментом. Хотя гексокиназа дрожжей не связывается с агарозо-(СН2)е-ацилглюкозамином, она удерживается на колонке с агарозо- (СН2)8-ацилглюкозамином и может быть элюирована с нее глюкозой. Для связывания фермента с этим адсорбентом необходимо неспецифическое взаимодействие. Изоферменты гексокиназы млекопитающих избирательно связываются с такими адсорбентами; хроматографию ферментов типов II и III можно провести на адсорбенте, имеющем в качестве удлиняющего мостика фрагмент Се, тогда как для удерживания почечного изофермента типа I необходим фрагмент С8.
Вычисления, проведенные выше, а также данные табл. 4.7 основаны на двух допущениях, которые могут не подтвердиться. Первое касается возможной гетерогенности распределения присоединенных лигандов; в ограниченных участках адсорбента величина mt может быть намного выше, поэтому даже при низких значениях констант связывания (например, Крс^. 10~4 М) с адсорбентом может связаться гораздо больше белка, чем можно было бы предположить. В одном из недавних исследований для анализа распределения лигандов использовали модельные спин-меченые лиганды [86]. Оказалось, что негомогенность в их распределении незначительна. Однако было обнаружено (путем подсчета на основе степени модификации), что при близком расположении лигандов друг от друга белок среднего размера может связываться с ними одновременно в нескольких участках (если белок имеет более одного центра связывания).
