Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Третий метод состоит в активации агарозы 1,1'-карбонил-диимидазолом. Образующийся при этом продукт так же реакционноспособен, как и цианат; при его взаимодействии с первичным амином положительный заряд не сохраняется, а образуется уретановая связь (рис. 4.38). Этот реагент менее ядо* вит, чем бромциан или бисоксираны.
Самый современный и, возможно, самый лучший метод — это использование толуолсульфонилхлорида (тозилхлорида) [80] или более реакционноспособного ЗДЗ-трифторэтансульфо-нилхлорида (трезилхлорида) [81]. Активация агарозы путем
Рис. 4.37. Взаимодействие эпоксиактивированной агарозы с гидроксильной «труппой.
О
Рис. 4.38. Активация агарозы карбонилдиимидазолом и реакция активированного носителя с амином.
Рис. 4.39. Получение тозилактивированной агарозы и ее реакция с амином.
152
Глава 4
введения в нее тозильной группы протекает легко и быстро; при этом из первичного амина лиганда образуется очень стойкий вторичный амин (рис. 4.39). При нейтральных значени-ях pH вторичная аминная группа заряжена, поэтому поведение адсорбента очень напоминает его поведение при активации бромцианом, но в этом случае образуется намного более стабильная связь.
На практике в приведенных выше примерах RNH2 представляет собой либо лиганд с удлиняющим мостиком, содержащим на конце заранее введенную аминогруппу, либо гексаметилен-диамин, образующий мостик, оканчивающийся другой первичной аминогруппой:
^>* + KH2(CH2)eNH2 -* \-NH(CH2)eNHa
Подробное описание химических процессов, происходящих при соединении лигандов и мостиков того или иного типа, выходит за рамки данного раздела; эти процессы подробно рассматриваются в других публикациях.
В настоящее время производится много различных носителей, используемых в качестве аффинных адсорбентов, причем они могут быть либо в «активированной» форме, либо связаны с удлиняющим мостиком, либо полностью готовы к работе. Готовые адсорбенты в большинстве случаев содержат общие лиганды, которые не обладают специфичностью по отношению к какому-то одному ферменту, а способны связываться с различными белками. В частности, были широко исследованы нуклеотидные лиганды, так как многие ферменты используют нуклеотиды как кофакторы или субстраты. Таким образом, хотя специфичность этих адсорбентов далека от абсолютной, они обычно дают хорошие результаты и применяются при работе с разными ферментами. Установлено, что 31% всех известных ферментов использует один из четырех нуклеотидных кофакторов [82]. Если к ним присоединить ферменты, для которых нуклеиновые кислоты служат в качестве субстратов, а также ферменты, для которых нуклеотиды играют роль активаторов или ингибиторов, то общее их число превысит 50%. Это не обязательно означает, во-первых, что 50% белка в данном экстракте составляют именно эти ферменты и, во-вторых, что многие из них будут непременно связываться с данным нуклеотидным аффинным адсорбентом в используемых условиях. Список имеющихся в продаже адсорбентов на 1978 г. представлен в работе [72]; более полные списки приводятся в каталогах основных фирм (P-L Biochemical, Sigma, Pharmacia, Bio-Rad).
Разделение белков путем адсорбции
153
Приложение теории хроматографии к аффинной адсорбции
Теорию, изложенную в разд. 4.1, можно применить к адсорбционной хроматографии и сделать при этом некоторые интересные выводы. Поскольку константа диссоциации комплекса адсорбента с белком (Кр) должна быть близка к константе диссоциации комплекса белка с лигандом или каким-то образом связана с ней, можно легко рассчитать величину коэффициента распределения. Один из недостатков аффинных адсорбентов заключается в том, что, хотя степень модификации может быть достаточно высокой (I—10 мкмоль-см-3), только незначительная часть иммобилизованного лиганда оказывается ориентированной должным образом даже при наличии удлиняющего мостика; обычно только 1—2% общего числа центров связывают белок. Хорошей считается емкость в 1—2 мг-см-3, что для белка с мол. массой 100000 соответствует величине mi от 0,01 до 0,02 мМ. Если допустить, что mt равно 0,02, a pt— 0,01 в уравнении (4.5), то можно вычислить величины а для различных значений Кр, данных в табл. 4.7.
Несколько неожиданным результатом является то, что для хорошей адсорбции (а>0,9) величина Кр должна быть ниже 0,001 мМ или 10_6 М, т. е. меньше, чем обычные константы диссоциации для комплексов белок—лиганд. Если учесть, что специфическое взаимодействие белка с иммобилизованным в колонке лигандом, вероятно, слабее, чем его взаимодействие со свободным лигандом, то естественно возникает вопрос, каким же образом осуществляется аффинная адсорбционная хроматография.
Ответ на этот вопрос был найден в процессе поисков удовлетворительных методов присоединения лигандов к носителю. Непосредственное их присоединение к матрице редко оказывалось успешным, однако использование удлиняющего мостика, состоящего обычно из шести метиленовых групп, улучшало адсорбцию. Тем не менее оставалась проблема неспецифических
Таблица 4.7. Значения а при mi=0,02 мМ и р( = 0,01 мМ.
