Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
1. Лиганд должен быть присоединен к матрице таким образом, чтобы при связывании его с белком не возникало серьезных затруднений.
2. Удлиняющий мостик между матрицей и лигандом должен облегчать доступ белка к лиганду (или служить другим целям — см. ниже).
3. Неспецифическое взаимодействие не должно быть слишком сильным, чтобы, за исключением нужного белка, все остальные белки не могли связываться с адсорбентом.
4. Связь лиганда с матрицей должна быть стабильна в условиях проведения хроматографии, в том числе в процессе «очистки» адсорбента перед его повторным использованием.
Синтез аффинных адсорбентов
В основе любого метода синтеза аффинных адсорбентов лежит один из двух общих приемов: лиганд (или его аналог) присоединяют к адсорбенту, уже -имеющему удлиняющий мостик,
ю*
148
Г лава 4
'
Матрица
Лиганд О + Мостик
Рис. 4.33. Альтернативные подходы к синтезу аффинного адсорбента. А. Удлиняющий «мостик» присоединяется к матрице, а затем с ним ковалентно связывается лиганд. Б. Удлиняющий «мостик» сначала присоединяется к лиганду, а затем лиганд с «мостиком» связывается с матрицей.
либо аналог лиганда, содержащий удлиняющий мостик, присоединяют к активированному адсорбенту (рис. 4.33). Удлиняющий мостик должен иметь реакционноспособные концевые группы, способные присоединяться к носителю и к лиганду. В некоторых случаях соединение лиганд — удлиняющий мостик синтезируют из компонентов меньшего размера и не в один этап. Примером может служить Ы6-аминогексил-АМР [74].
С химической точки зрения процесс активации носителя лредставляет собой реакцию с участием гидроксильных групп агарозной матрицы; чаще всего используют реакцию с бромцианом. Первоначальная методика [75] была заменена более простой, в которой вся реакция завершается за несколько минут [76]. Широко применяется имеющаяся в продаже активированная бромцианом агароза. Реакция с бромцианом достаточ-«о сложная: как показано на рис. 4.34, образуются циклические (I) и ациклические (II) имидокарбонаты, а в качестве побочных продуктов — некоторое количество карбаматов (III)
Разделение белков путем адсорбции
149
NH
с=о
NH0
111
0-C = N
С —О
IV
Рис. 4.34. Продукты реакции бромциана с агарозой. I — циклический имидо-карбонат, II — ациклический имидокарбонат, III — карбамат, IV — карбонат, V — цианат.
и карбонатов (IV), но основным реакционноспособным компонентом является цианат (V) [77]. В препаратах сефарозы, активированной бромцианом (фирма Pharmacia), нестойкие в кислой среде имидокарбонаты разрушают, обрабатывая эти препараты кислотой.
В слабощелочной среде (pH 9—10) активированная агароза быстро взаимодействует с первичными аминами с образованием главным образом производного изомочевины (рис. 4.35). В ре-
0—с=ы
+ 1МН2—R
+ NH,
II '
О—С—NH—R
Рис. 4.35. Взаимодействие цианата (рис. 4.34, V) с аминосоединением, в результате которого образуются производные изомочевины.
150
Глава 4
ОН
]
,0—СН-—СН—СН9—О—(СИ ) —О—СИ. — СИ — СИ,
V *
Рис. 4.36. Агароза, активированная бисоксираном (эпоксиактивирование).
зультате одновременно идущего гидролиза образуются карбаматы (III), и карбонаты (IV), показанные на рис. 4.34.
При нейтральных значениях pH это производное изомочеви-ны заряжено положительно, что влияет на поведение аффинных адсорбентов, придавая им характер анионообменников. С другой стороны, многие присоединенные лиганды несут отрицательный заряд, поэтому производное изомочевины может нейтрали-зовать возможные катионообменные эффекты, сохранив при. этом биполярный ионный характер [69].
Хотя активация агарозы бромцианом до сих пор остается наиболее широко применяемым методом, особенно при ее использовании для присоединения белков через е-лизиновые группы (см. разд. 4.7), в настоящее время разработаны и другие, более совершенные и эффективные методы, которые, безусловно, с успехом заменят активацию бромцианом. Первый метод — это «эпоксиактивация^» при которой в агарозу вводят эпоксидную группу, используя в качестве ее источника диглицидныв эфир 1,4-бутандиола (биссксиран) (рис. 4.36) [78].
В последнем случае одновременно происходит и введение удлиняющего мостика, так как между носителем и реакционно* способной эпоксидной группой находится 11 атомов. Эпоксид-ные группы несколько более реакционноспособны, чем циана-ты; они не только вступают в реакцию с первичными аминами,, но и взаимодействуют с гидроксильными группами, образуя соединения с простыми эфирными связями (рис. 4.37). Реакцию проводят при pH 8,5—11; взаимодействие с гидроксильными группами идет медленно и завершается через 24 ч при комнатной температуре.
