Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
ли имеют дело с ферментами, связывающими фосфорилирован-ные субстраты. Путем адсорбции на фосфоцеллюлозе обычно очищают ферменты, воздействующие на нуклеиновые кислоты. Несколько тРНК-синтетаз было успешно элюировано с фосфо-целлюлозы с помощью РНК-субстратов [61]. Глюкозо-6*фос-фат — дегидрогеназа [63], гексокиназа [63] и глюкозофосфат-изомераза [56] также могут связываться с фосфоцеллюлозой и специфически элюироваться с нее; в этих случаях можно предполагать, что специфическое действие проявляют фосфорилиро-ванные невосстанавливающие концы целлюлозы (рис. 4.31). Но в большинстве других случаев фосфоцеллюлозу следует рассматривать просто как ионообменник, поведение которого было описано в предыдущем разделе.
Ион [64, 65] ввела понятие «мультифункциональные адсорбенты», которые содержат как положительные, так и отрицательные гидрофобные группы, ковалентно-соединенные с агарозой:
—О—С—NH—(СН2)Л—NH—СО—(СН2)Л—СОО",
'I
+nh2
где 8 или 10.
Первоначально эти группы служили удлиняющими мостиками для аффинных адсорбентов, однако затем было установлено, что они обладают «неспецифическими» адсорбционными свойствами благодаря своей мультифункциональной природе. Био-специфическая элюция с этих адсорбентов, называемых «имфи-литами», в ряде случаев оказалась успешной [66, 67]. Интерпретация адсорбции и элюции при использовании имфилитов намного сложнее, чем в случае ионообменников, так как здесь совсем неизвестна подлинная природа связывания белка. Будучи потенциально полезными, эти адсорбенты были в значительной степени вытеснены окрашенными (т. е. связанными с красителями) адсорбентами, которые функционируют также за счет гидрофобных и электростатических взаимодействий (разд. 3.6). Главную проблему представляет низкая адсорб-
ер
о Я
но
,он
он
10—1078
146
Глава 4
дионная емкость имфилитов; на 1 см3 адсорбента/рекомендуется использовать всего 100 мкг белка [65].
Порат [68, 69] ввел в употребление диполярные ионообмен-;ники (см. также разд. 4.8), обладающие высокими адсорбционными емкостями, но по своему поведению несколько отличающиеся от ионообменников. Они содержат как положительно, так и отрицательно заряженные группы. Изучение этих адсорбентов *с целью их использования для аффинной элюции, по-видимому, <5удет оправдано.
4.5. АФФИННАЯ АДСОРБЦИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Чтобы не путать с предыдущим разделом, этот раздел, в котором описано то, что обычно понимается под названием «аффинная хроматография», озаглавлен «Аффинная адсорбционная хроматография». В этом случае биоспецифический отбор происходит на стадии адсорбции, так как выделяемый белок обладает специфическим сродством к адсорбенту благодаря его способности связывать лиганд (рис. 4.32). Нет четкого разделения между действительно специфическими аффинными адсорбентами, которые кроме белков, имеющих центры связывания для иммобилизованного лиганда, связывают мало других белков, и адсорбентами общего типа, которые хотя и проявляют специфичность к определенным классам белков, связывают также *г многие другие. Описание адсорбентов второго типа можно начать с окрашенных адсорбентов, обладающих значительной избирательностью к ферментам, имеющим нуклеотидсвязывающие центры, а затем перейти к таким адсорбентам, как фосфоцел-люлоза, которая, будучи в основном ионообменником, часто используется в качестве псевдоаффинного носителя для белков, связывающих нуклеиновые кислоты [70], и ферментов, взаимодействующих с фосфорилированными сахарами [62, 63]. Хотя
Рис. 4.32. Основной принцип аффинной адсорбционной хроматографии. Лиганд L ковалентно присоединен к цепи носителя. Адсорбент связывает только молекулы фермента Е, обладающего специфическим сродством к L. Белки Р проходят через колонку, не связываясь с адсорбентом.
Разделение белков путем адсорбции
14 Г
и существуют некоторые готовые нерастворимые материалы,-имитирующие субстрат или являющиеся настоящими субстрата-тами, например крахмал (для амилаз — ферментов, участвующих в метаболизме гликогена), целлюлоза (для целлюлаз) и. фосфоцеллюлоза (см. выше), во всех остальных случаях аффинные адсорбенты необходимо синтезировать, ковалентно соединяя лиганд с подходящим носителем. При выборе носителя руководствуются теми же соображениями, что и при использовании его в качестве ионообменника — а именно носитель должен быть пористым гидрофильным полимером, который можно производить в виде частиц нужного размера, что обеспечивает свободный доступ макромолекул к соединенному с носителем лиганду и адекватный поток буфера в наполненной этим носителем колонке. При работе с глобулярными белками очень широко используются сферические гранулы агарозы, имеющие предел исключения, равный примерно 107 дальтон; однако применяются и другие адсорбенты, которые в ряде случаев могут обладать теми или иными преимуществами. В настоящее время все большее распространение получают поперечно-сшитые гранулы агарозы, так как они не разрушаются и сохраняют свои размеры как под давлением, так и при смене буфера или растворителя. Обычно применяются сефароза-4В и сефароза CL6B (Pharmacia), а также агарозы фирмы Bio-Rad. Здесь мы только кратко коснемся методов присоединения лиганда к матрице; более полно этот вопрос освещен в последних публикациях, посвященных исключительно технике аффинной адсорбции [71—73]. Ниже перечислены основные требования к аффинной адсорбции.
