Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
« ри можно из зависимости а от / определить Кь, констаиту диссоциа-
ции комплекса фермент — лиганд. Следует отметить, что I — концентра-
142
Глава 4
Рис. 4.27. Титрование лигаидом смеси фермента с адсорбентом и определение величины а (методы см. [38]). Величину Кр можно рассчитать, подставив величины а0 и т* в уравнение (4.6). К1р можно вычислить исходя из величин cti и ти
ция свободного лиганда, а не общая его концентрация. Поэтому можно определить величину Kl, если фермент имеет только один центр связывания с лигандом, и величина а измерена при фиксированном значении pH и изменяющихся значениях I (как на рис. 4.27). Однако возникают сложности, обусловленные тем, что Кр и К1р — это не истинные величины, а лишь средние значения непрерывного ряда величин для данных условий.
Если существует несколько центров связывания, то, хотя анализ кривой a—L теоретически позволяет определить индивидуальные константы диссоциации неполностью насыщенных форм, практически невозможно получить их точные величины. Но можно сделать некоторые вычисления для второго случая, когда все К1р = °°. Эти расчеты показывают, в какой степени вытеснение белка из адсорбента зависит от соотношения между концентрацией лиганда и его константой диссоциации, а также, в частности, насколько более эффективное действие при аффинной элюции оказывает наличие множественных центров связывания, если используется низкая концентрация (свободного) лиганда. В присутствии многих центров связывания с белком связывается больше лиганда, но общее его количество, необходимое для заданного снижения величины а, уменьшается. Следовательно, к вышеперечисленным свойствам белка, необходимым для успешного проведения аффинной элюции, следует добавить еще одно желательное (хотя и необязательное) свойство — наличие многих центров связывания.
Уравнение для а в отсутствие лиганда в зависимости от pt, mt и Кр было дано выше (4.5):
Р<«2 — iPt + Щ + Кр) а + mt = 0.
Если лиганд L (концентрация I, константа диссоциации /(ь), связываясь с белком, полностью вытесняет его из адсорбента (т. е. /(*/>«= оо)„
в присутствии лиганда, рассчитанные для взаимодействия моновалентного фермента с лигандом из уравнения (4.9). Предполагается, что а) сдвиг, индуцируемый лигандом, происходит только вследствие увеличения заряда и 6) суммарный заряд белка линейно зависит от величины pH в этой области. Кривые справа налево отвечают концентрациям лиганда, превышающим Кь соответственно в О, 1,3, 10 и 100 раз.
Рис. 4.29. То же, что и на рис. 4.28, но для поливалентных ферментов. Кри-вые 1, 2, 3 и 4 показывают величину а для ферментов с 1, 2, 3 и 4 центрами связывания для лиганда L, концентрация которого в каждом случае в 2 раза превышает величину
144
Глава 4
т
Рис. 4.30. Сдвиг кривой зависимости а от pH для лактатдегидрогена-зы в присутствии NADH [38]. В данном случае сдвиг обусловлен не только введением заряда, но и в некоторой степени конформацион-ными изменениями. Показана также теоретическая кривая (прерывистая линия) при К*р =
то новая величина а при концентрациях, близких к насыщению, выразится уравнениями
р/*2 — + + +-^-jja + mt=o (4.9)
для мономера и
pta2 — \pt + mt + Kp
1 +
П(те)
(4.10)
для n-мера, если все величины К1р бесконечны.
На рис. 4.28 и 4.29 даны кривые а/pH, рассчитанные для разных условий. Следует отметить, что кривые сдвинуты в сторону более низких значений pH, но форма кривых не меняется. Это относится как к белкам с многими центрами связывания, так и к мономерам. Для типичного тетрамера сдвиг pH становится значительным, как только I превосхо-
п
дит Kl, потому что выражение [1+Пр//СУ] быстро растет.
В действительности необходим более сложный анализ, так как pH снижается, а величины К'р не бесконечны. Однако качественно можно видеть, что конечное значение величин К1р приводит к более сильной адсорбции, поэтому величины а обычно бывают выше теоретически предсказанных (рис. 4.28) в области более низких значений pH. Следовательно, в присутствии лиганда происходит более резкое возрастание реальной величины а в ответ на изменение pH, чем это показано на рис. 4.28. На рис. 4.30 представлены результаты эксперимента с лактатдегидроге-назой и дана соответствующая теоретическая кривая при =
Аффинная элюцмя с других неспецифических адсорбентов
Фосфоцеллюлоза представляет собой один из ионообменников, применявшихся во многих опубликованных работах по проведению аффинной элюции. Однако при использовании фосфо-целлюлозы наблюдаются специфические эффекты, особенно ес-
Разделение белков путем адсорбции
145
сн2он
h°ч >о‘‘
Рис. 4.31. Фосфорилированная по невосстанавливающему концу фос-фоцеллюлоза, применяемая в качестве аффинного лиганда для глюко-зо-6-фосфатдегидрогеназы и фосфо* глюкозоизомеразы. ОН
