Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Детальное изучение адсорбции различных ферментов на КМ-целлюлозе в присутствии субстрата и без него показало, что в некоторых случаях наблюдаемый эффект был больше ожидаемого: в присутствии лиганда кривые зависимости а от pH были сдвинуты в сторону более низких значений pH [38]. При фиксированном значении а можно подсчитать общий заряд фермента и комплекса фермент — субстрат, используя два значения pH, соответствующих величинам а на кривых титрования. Для некоторых ферментов было установлено, что указанный сдвиг целиком обусловлен изменением заряда, происходящим при титровании фермента в этой области pH. Например, кривая зависимости а от pH для пируваткиназы из мышц кролика в присутствии 0,1 мМ фосфоенолпирувата сдвигается только на
0,25 единицы pH. Предполагается, что этот тетрамерный фер^ мент приобретает 12 отрицательных зарядов при полном насыщении его субстратом. Однако если pH изменяется на 0,25 единицы, то фермент теряет только восемь положительных зарядов. В этом случае 0,1 мМ фосфоенолпирувата, вероятно, недостаточно для насыщения фермента. С другой стороны, лактатде-гидрогеназа, связывая четыре молекулы NADH, приобретает восемь отрицательных зарядов, что соответствует сдвигу pH приблизительно на 0,8 единицы (в области pH 8,5—7,0). Но фактически добавление 0,1 мМ NADH приводит к сдвигу pH на 1,5 единицы, что почти в два раза больше ожидаемого эффекта. Аналогичный эффект наблюдался и в случае фосфогли-цераткиназы из дрожжей [48]. Сдвиги при связывании этого фермента с 3-фосфоглицератом или АТР были значительно больше ожидаемых, а с 1,3-бисфосфоглицератом — еще больше*
Можно предложить два других объяснения эффекта аффинной элюции. Помимо того что лиганд снижает общий заряд белка, он связывается с центром, в котором сосредоточены заряды, противоположные по знаку заряду лиганда. Такое связывание может маскировать достаточно специфичное сильное взаимодействие между этими зарядами и адсорбентом. Кроме того, поскольку активный центр фермента расположен, вероят-1 но, близко к поверхности белковой молекулы, заряженные остатки активного центра оказывают более сильное влияние на
138
Глава 4
общее взаимодействие между белком и адсорбентом, чем другие заряды, расположенные дальше от поверхности молекулы. Маскирование этих зарядов лигандом в значительно большей «степени ослабляет указанное взаимодействие, чем потеря равного числа зарядов, беспорядочно распределенных на молекуле «белка.
Кроме того, при связывании с лигандом могут происходить конформационные перестройки белка. Известно, что конформационные изменения действительно имеют место [59, 60], и они могут значительно изменить взаимодействие белка с адсорбентом в любом направлении. Убедительных доказательств кон-формационных изменений, приводящих к более прочной сорбции, не было получено, хотя для некоторых ферментов, особен-|»о для енолазы из дрожжей, эффекты, связанные с аффинной элюцией, столь слабы (значительно слабее ожидаемых эффектов при изменении заряда), что такие усиливающие сорбцию конформационные изменения вполне могут существовать. Конформационные изменения, вызывающие ослабление адсорбции, по-видимому, действительно имеют место, особенно в случае 4>осфоглицераткиназы, аденилаткиназы и лактатдегидрогеназы ?38, 48].
В общем можно сказать, что аффинная элюция эффективна, если фермент и лиганд обладают следующими свойствами:
а) Фермент адсорбируется, не инактивируясь, на ионообмен-«ике, имеющем тот же знак иммобилизованного заряда, что и используемый при аффинной элюции лиганд. В случае анионо-обменников (ДЭАЭ) лиганд должен быть положительно заряжен; при использовании же катионообменников (КМ, фосфо « т.д.) лиганд должен нести отрицательный заряд.
б) Лиганд способен связываться с ферментом при таком значении pH, при котором фермент в отсутствие лиганда оста-¦ется связанным на колонке (на практике при минимальном значении а, равном 0,9).
в) Число зарядов, привносимых лигандом на каждые 105 дальтон мол. массы фермента, должно равняться по меньшей мере четырем, если только дополнительное конформационное изменение не будет способствовать элюции.
г) Константа диссоциации лиганда должна быть ниже 10-3 М, и чем она меньше, тем лучше.
Из-за ограничений, указанных в пункте а, и ввиду того, что практически все лиганды (за исключением ионов металлов) отрицательно заряжены, аффинная элюция с ионообменников осуществляется только применительно к нейтральным и основ-«ым белкам, которые адсорбируются на катионообменнике при нейтральных значениях pH (6—8). Аффинная элюция (ионами Mg2+) наблюдалась в процессе очистки пируваткиназы, адсор-
Разделение белков путем адсорбции
13»
бированной на ЧАЭ-сефадексе при высоких значениях pH (Скоупс, неопубликованные данные). Однако она была очень слабой вследствие ограничений, указанных в пунктах виг. Возможно, что по отношению к таким ферментам, как аргинин-киназы, очистку которых проводят на ДЭАЭ-целлюлозе, можно< более успешно использовать аффинную элюцию (аргинином),, хотя положительный эффект ослабляется из-за ограничений* упомянутых в пунктах виг. Реже встречаются поликатионные лиганды. У многих ферментов из животных тканей изоэлектри-ческие точки лежат в области, приемлемой для катионообменной аффинной элюции (>рН 6), но соответствующие ферменты растений и микроорганизмов имеют более низкие значения изоэлектрических точек. Поскольку эффективность рассматриваемых методов решающим образом зависит от величины изоэлектрических точек, они являются видоспецифическими. При> замене одного вида организма другим может возникнуть необходимость в изменении значения pH буфера для проведения* процесса в оптимальных условиях.
