Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
4.4. АФФИННАЯ ЭЛЮЦИЯ С ИОНООБМЕННИКОВ И ДРУГИХ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ АДСОРБЕНТОВ
Большинство исследователей под аффинной хроматографией понимают использование иммобилизованного на адсорбенте лиганда, осуществляющего специфический отбор связывающихся с этим лигандом белков (разд. 4.5). После адсорбции фермент может быть элюирован либо неспецифическим образом, например, путем повышения концентрации соли, либо специфическим в результате замещения белка свободным лигандом в растворе. Следовательно, аффинная хроматография может включать две специфические стадии — «аффинную адсорбцию» и «аффинную элюцию». Механизм элюции со специфического адсорбента достаточно ясен. С практической точки зрения присутствие лиганда снижает коэффициент распределения с ~1,0 до значитель-
134
Глава 4
Рис. 4.22. Принципы аффинной элюции с катионообменника. Л. Положительно заряженный белок адсорбируется на ионообменнике. Б. Введен отрицательно заряженный лиганд, который при связывании с белком уменьшает его общий заряд. В. Белок элюируется, так как величина а уменьшается благодаря снижению общего заряда белка.
но более низких величин. Однако это может происходить и при использовании других адсорбентов; термин аффинная элюция не означает, что сам адсорбент обладает какими-либо особыми свойствами. Аффинная элюция с ионообменников представляет собой очень удобный и специфичный метод очистки многих ферментов, в котором используется определенное сочетание свойств этих ферментов [54—58].
На рис. 4.22, 4.23 и 4.24 схематически представлены основные принципы аффинной элюции с ионообменников. Фермент
Рис. 4,23. Принципы аффинной элюции с катионообменника. А. Наносится смесь белков; нужный фермент адсорбируется, а часть других белков проходит через колонку. Б. Величина pH повышается настолько, что фермент начинает двигаться вниз по колонке (0,8 < а < <0,95); некоторые другие белки могут полностью элюироваться (а<0,8). В. Добавление специфического лиганда приводит к снижению величины а (0<а< <0,5), при этом нужный фермент выходит из колонки.
Нанесение образца Повы шение pH
/ /
Добавлен лиганда /
Ш щ
* .
•
* *
Лигандг
В
Рис. 4.24. Проведение аффинной элюции. Л. Образец наносят при там же значении pH, при котором проводят элюцию; влияние лиганда настолько велико, что величина а уменьшается от >0,95 до очень низкой величины. Б. Образец наносят при рНА, когда а—1,0, затем повышают pH до В, чтобы снизить величину а примерно до 0,9. В результате добавление лиганда оказывает значительное влияние (как показано на рис. 4.23). В. То же, что и на рис. Б, но с «подставным» лигандом. На практике «подставной» лиганд можно использовать, когда начинают промывать колонку буфером с рНв-Заштрихованные пики представляют собой элюированный фермент.
136
Глава 4
адсорбируется на ионообменнике при определенном значении pH м удерживается на нем с помощью достаточно сильных электростатических взаимодействий между матриксом адсорбента и зарядами белка; при этом коэффициент распределения близок к 1,0. Если фермент связывается с лигандом, несущим заряд, противоположный суммарному заряду фермента, то заряд фермента снижается. В соответствующих условиях снижение суммарного заряда фермента значительно ослабляет электростатическое взаимодействие с адсорбентом, что приводит к существенному снижению коэффициента распределения. В результате величина а может снизиться с 0,95 (когда зона фермента медленно движется по колонке со скоростью, составляющей 1/20 скорости потока буфера) до 0,5 (когда скорость перемещения фермента равна 1/2 скорости перемещения буфера). Это приводит к специфической элюции только одного интересующего нас фермента, за исключением тех случаев, когда с лигандом связываются также другие белки, имеющие сходные адсорбционные характеристики. Первыми белками, к которым был успешно применен этот метод, были фруктозо-1,6-бисфосфат—альдола-за и фруктозо-1,6-бисфосфатаза [54, 55]. В обоих случаях тет-рамерный фермент (мол. масса около 150000) связывает четыре молекулы субстрата, несущих по четыре отрицательных заряда каждая. Поэтому при снижении общего (положительного) заряда на 16 единиц происходит значительное ослабление адсорбции (рис. 4.25). Вычисления, основанные на эксперимен-
рн
Рис. 4.25. Сдвиг кривой зависимости а от pH для альдолазы кролика в присутствии 0,1 мМ фруктозо-1,6-бисфосфата (ФБФ) [38].
Разделение белков путем адсорбции
137
тальных величинах [38], показывают, что в случае альдолазы кролика, связанной на КМ-целлюлозе при pH 7,1, введение до* полнительных зарядов вызывает снижение величины а с 0,95 до 0,01. Даже если изначальная адсорбция намного сильнее (например, а = 0,995), добавление субстрата приводит к снижению величины а до 0,35. Однако многие ферменты не связывают та-кое большое число молекул субстрата, к тому же субстраты их могут быть незаряжены. Поэтому можн.) ожидать, что общий эффект будет слабее, чем в случае с альдолазой.
