Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Разделение белков путем адсорбции
131
так и, самое главное, по стоимости. Дорогостоящий насос должен обеспечивать возможность непрерывно изменять скорость потока при минимальной пульсации и работать под большим давлением без снижения скорости потока. Однако многие из этих качеств, в частности последнее, не всегда необходимы, так как иногда лучше снизить скорость потока, которому препятствует возрастающее из-за закупорки колонки давление, чем порвать трубки и продолжать качать жидкость на лабораторный стол. Обычно в процессе работы давление не должно повышаться, а если это происходит, значит, что-то неисправно. Помимо великолепных насосов, выпускаемых многими фирмами (LKB, Pharmacia, Ismatec), специализирующимися на биохимическом оборудовании, существуют более простые и дешевые модели, пригодные для различных целей.
В заключение приведем некоторые сведения о ступенчатой элюции солевыми растворами. Острые пики, содержащие фермент, могут быть получены при ступенчатом нанесении буферных растворов с более высокой ионной силой — это быстрый и эффективный способ очистки фермента. Однако, из-за того что многие другие факторы, а именно концентрация белка, наличие слабых и сильных центров связывания (разд. 4.1), также влияют на величину а, мало вероятно, что такая простая система элюции даст хорошие результаты. Она может быть эффективной только в том случае, если ступень с измененной концентрацией соли достаточно широка. При значительном повышении концентрации соли вместе с нужным белком могут_элюироваться
Рис. 4.20. Ступенчатая элюция белков с ионообменной колонки при повышении концентрации соли [29]. Фермент (прерывистая линия) распределяется между двумя пиками, но это не обязательно означает, что он существует в двух формах. Следует отметить четкие передние границы и длинные «хвосты» в пиках элюированных белков (см. текст).
9*
132
Глава 4
и многие другие белки. Резкое снижение величины а из-за наличия соли приводит к выносу большей части фермента. Однако размывание задней части пика оказывается значительным, и для элюции оставшегося фермента необходимо дальнейшее повышение концентрации соли (рис. 4.20). Появляющийся при этом второй пик не является другой формой фермента — было бы неблагоразумно делать заключение о существовании изоферментных форм на основе процесса ступенчатой элюции. Размывание пика уменьшается при наличии градиента— именно это и служит одной из главных причин столь широкого использования градиентной элюции (рис. 4.15).
В отношении ионообменной хроматографии важно отметить еще несколько моментов. Хотя, согласно простым теориям, условия элюции прямо противоположны условиям адсорбции, на практике часто наблюдается гистерезис. Особенно это характерно для фосфоцеллюлозы, но отмечается также и при работе с другими адсорбентами, такими, как аффинные и модифицированные красителем лигандные адсорбенты (разд. 4.5 и 4.6). Гистерезис означает, например, что величина а, наблюдающаяся при использовании в процессе адсорбции того или иного буфера с определенной ионной силой, будет отличаться от величины а, когда тот же буфер используют для элюции. Так, на рис. 4.21 ионная сила А вполне достаточна для адсорбции, тогда как ионная сила В мала для элюции и слишком велика для адсорбции. Эти эффекты можно объяснить тем, что данные процессы неидеальны и неравновесны; кроме того, здесь действуют и другие факторы, не учитываемые простой теорией.
а в
Рис. 4.21. Гистерезис в ионообменной хроматографии. Из-за неравновесности происходящих процессов условия адсорбции несколько отличаются от условий элюции; при этом они более чувствительны к изменениям (см. текст).
Разделение белков путем адсорбции
133
Еще одно не менее важное в отношении катионообменной хроматографии наблюдение касается влияния других заряженных полимеров, особенно нуклеиновых кислот, присутствующих в наносимом образце. Электростатическое притяжение между заряженными макромолекулами может быть достаточно сильным при низкой ионной силе, используемой в ионообменной хроматографии, и положительно заряженные белки будут взаимодействовать с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами. Образовавшийся комплекс несет меньший по величине суммарный положительный заряд или даже может быть заряжен отрицательно и потому не связывается с катионообменни-ком. Простой способ, который можно применить, чтобы избежать этого нежелательного явления, заключается в обработке образца поликатионом (обычно протамином), избирательно осаждающим нуклеиновые кислоты при незначительных потерях белка. Протаминсульфат, используемый в концентрации 1 г на 20—40 г белка, перед добавлением к образцу предварительно растворяют в воде и доводят pH до нейтрального значения, так как этот поликатион обладает сильными кислотными свойствами. Ионная сила не должна быть высокой (<0,1). Комплексы нуклеиновых кислот с протамином образуются также за счет электростатических взаимодействий, и при высокой концентрации соли распадаются. Если было добавлено достаточное количество протамина, образуется обильный кремово-белый осадок, который можно удалить центрифугированием при умеренной скорости. Во многих случаях делается заключение о том, что катионообменная хроматография непригодна для работы с данным ферментом, так как он «не прилипает» к катио-нообменнику, тогда как истинная причина неудачи кроется в присутствии нуклеиновых кислот.
