Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
В большинстве случаев нужный фермент прочно связывается с адсорбентом в процессе нанесения, и для его элюции не-•обходимо сменить буфер. Существуют три способа снижения величины а при использовании ионообменников: а) изменение pH ^повышение для катионообменников и понижение для анионо-
Разделение белков путем адсорбции
129
обменников; б) повышение ионной силы и в) аффинные методы. Метод в детально описан в разд. 4.4; метод 6, используемый чаще других, применяется как в ступенчатой, так и в ipa-диентной форме. Метод о, т. е. изменение pH, можно применять при условии, что буферная емкость нового буфера достаточно высока, чтобы оттитровать молекулы белка и группы адсорбента, которые могут приобрести или потерять заряд в результате изменения pH (разд. 4.2). При ступенчатом методе элюция путем изменения pH может быть весьма успешной. Изменение pH из-за указанного процесса титрования происходит медленнее, чем перемещение фронта нового буфера, но в конечном счете белковый пик выходит из колонки в тот момент, когда pH резко изменяется. При градиентной элюции медленное изменение pH обычно бывает эффективным только в том случае, если буфер обладает высокой буферной емкостью и, следовательно, высокой ионной силой (разд. 4.2).
Важно помнить, что типичная кривая титрования белков становится крутой, если pH ниже 5,5 (или выше 9,5), но при pH 7—8,5 она очень полога. Таким образом, градиенты pH должны охватывать обширную область вблизи нейтральных значений pH, но острый пик белка может быть получен и в узком интервале pH, далеком от нейтральной области. Высокие значения pH обычно не используются вследствие а) недостаточной стабильности ферментов при значениях pH выше 9 и
б) отсутствия подходящих адсорбентов. ДЭАЭ-адсорбенты в этих условиях теряют заряд, и лишь немногие белки обладают при таких высоких значениях pH достаточно сильными основными свойствами, чтобы присоединиться к катионообменни-кам. Некоторые ферменты довольно стабильны при pH 4—6: С ними можно работать при низких значениях pH как на ДЭАЭ-адсорбентах, так и на катионообменниках в зависимости от изоэлектрической точки выделяемого фермента (в связи с этим следует учитывать эффект Доннана, см. рис. 4.11). Хорошим примером служит разделение двух изоферментов гексоки-назы дрожжей на ДЭАЭ-целлюлозе при pH 5,6—5,2 [53]. При снижении pH всего лишь на какую-то долю единицы остатки аспарагиновой и глутаминовой кислот протонируются и, следовательно, градиент pH становится очень пологим.
Градиент ионной силы не создает никаких трудностей, связанных с неправильным поведением белков, — повышение концентрации соли на выходе из колонки происходит так же постепенно, как и на входе. Концентрация соли, необходимая для элюции белков, в значительной мере зависит от их изоэлектри-ческих точек, однако некоторые белки остаются обратимо связанными с ионообменниками при I выше 0,5; для их десорбции иногда требуются высокие концентрации соли, но обычно не
9—1078
130
Глава 4
Солевой
раствор
Винтовая»
мешалка
Солевой
раствор
К колонке
К колонке
шие смесители для получения градиентов (линейных градиентов).
Рис. 4Л9. Простей-
Магнитная мешалка
выше 1 М. Высокие концентрации соли, как правило, необходимы при работе с ДЭАЭ-целлюлозой, поскольку изоэлектриче-ские точки белков чаще лежат ниже рКа остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот (<рН 4,5—5). Ситуации, когда изоэлектрические точки белка оказываются выше рКа остатков лизина (>рН 10), довольно редки. Суммарный заряд (в нейтральной среде) белков с низкими изоэлектрическими точками может быть довольно высоким, а суммарный заряд белков с высокими изоэлектрическими точками обычно ниже. Редко бывает, чтобы белки оставались адсорбированными на КМ-целлюло-зе при нейтральных значениях pH в присутствии 0,2 М соли. Фосфоцеллюлоза в этом отношении отличается от других адсорбентов— она ведет себя в какой-то степени подобно аффинным адсорбентам. Часто необходима достаточно высокая концентрация соли, для того чтобы нарушить псевдоспецифическое связывание.
Градиенты (ионной силы или pH) можно создать с помощью простого имеющегося в продаже оборудования, состоящего из двух емкостей, соединенных в нижней части. Емкость, из которой выходит буфер, снабжена лопастной мешалкой. Еще проще использовать два стакана с магнитной мешалкой для перемешивания буферного раствора (рис. 4.19). Намного сложнее миксеры с электронным управлением, которые в основном используют для рутинных, часто повторяемых процедур, а не для разработки новых препаративных методов. Применение этих миксеров позволяет получить любой градиентный профиль. К счастью, без этого оборудования, стоимость которого на три порядка выше стоимости метода с применением двух стаканов, можно вполне обойтись в лаборатории по очистке белков. Однако при использовании последнего метода необходимо иметь магнитную мешалку и насос. Установив смешивающее приспособление для создания градиента над колонкой, можно работать, подавая жидкость самотеком, но лучше пользоваться перистальтическим насосом, обеспечивающим постоянство потока. Выпускаемые насосы различаются как по форме и размерам,
