Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
ется, то разумно будет нанести его на колонку объемом 50— 100 см3 в 100 мл буфера. При этом верхняя часть колонки объемом 15—20 см3 будет занята адсорбированными белками. Эти вычисления относятся к белкам, обладающим значительной адсорбционной способностью, для которых величина а очень близка к 1,0. Если же в смеси содержатся белки с величиной а выше нуля, но ниже 0,95, они будут удерживаться лишь частично и в процессе нанесения распределяться вниз по колонке.
На первых этапах развития ионообменной хроматографии белков использовали очень длинные и узкие колонки. Хотя они идеальны для проведения истинной хроматографии, низкая скорость потока, обусловленная конфигурацией этих колонок, приводит к увеличению времени разделения, что иногда плохо отражается на белках (разд. 7.1). В настоящее время чаще применяются более короткие и широкие колонки, длина которых в 4—5 раз превышает их диаметр. Теоретически при абсолютно равномерном нанесении пробы и столь же равномерном протекании жидкости через колонку ее форма не должна иметь значения, если не учитывать размеров частиц, влияющих на эквивалентное число «теоретических тарелок» (рис. 4.17; см. также разд. 5.1). На практике же трудно получить абсолютно равномерный поток через колонку и более длинные колонки при неравномерном потоке дают более удовлетворительные результаты (при данной линейной скорости потока), но при их использовании требуется больше времени для хроматографического разделения. Для рутинной работы рекомендуются колон-
Разделение белков путем адсорбции
127
ки, длина которых в 4—5 раз превышает их диаметр. При ступенчатой элюции применяют еще более короткие ионообменные колонки: их длина должна быть только в 1—2 раза больше диаметра.
При установлении скорости потока всегда следует пойти на компромисс между стремлением добиться совершенного хроматографического поведения белков (при нулевой скорости потока!) и возможностью получить быстрое, хотя и менее тонкое их разделение за минимальное время. Современные материалы настолько хорошо заполняют колонку, что она может работать со скоростью до 100 см-ч”1*; однако это слишком высокая скорость для большинства процедур. Желательно, чтобы скорость потока была 10—30 см*ч~!, а в некоторых случаях эту скорость нужно снизить еще больше, так как колонка не может работать быстрее из-за большого количества адсорбированного (и иногда выпавшего в осадок) белка в ее верхней части, а порой и из-за вязкости растворов неглобулярных белков. Закупорку колонии вследствие осаждения или денатурации белков можно временно устранить, осторожно разрушив поверхностный слой. Тем не менее этого нужно по возможности избегать. Никогда не следует наносить образец, в котором есть осадок; его надо сначала отцентрифугировать или отфильтровать при тех же pH, ионной силе и температуре, при которых образец будет наноситься на колонку.
Методы элюции белков с ионообменников1
Перед тем как приступать к описанию различных методов десорбции белков и вытеснения их из ионообменников, полезно напомнить две ситуации (разд. 4.1)—тривиальную ситуацию» когда а = 0 и белок проходит через колонку, и промежуточную, когда а значительно больше 0, но существенно меньше 1. При а = 0 все сходные белки (обычно имеющие тот же заряд, что и адсорбент) проходят сквозь колонку и, если не считать пограничных эффектов за счет различной степени молекулярной экс-клюзии, собираются во фракции, объем которой незначительно превышает нанесенный объем. Если требуемый фермент находится в этой фракции, а большая часть белков удерживается на колонке, то это великолепный метод очистки, дающий обычно 100%-ный выход фермента. Хотя при такой процедуре, когда нужный белок не адсорбируется, реализуются не все воз-
* Линейную скорость потока, выраженную в см*ч-1, можно пересчитать на объемную скорость (в см3*4“’), умножив ее на поперечное сечение колонки в см2.
1 См. разд. 4.2.
128
Глава 4
Объом элюции Ьаединицу принят объем колонки)
Л в
Рис. 4.18. Элюция с ионообменника неадсорбированного (а=0) и задержанного (а=0Д заштрихован) белков. Л. Объем образца составляет менее 0,5 объема колонки. Б. Объем образца равен одному объему колонки. Заметьте, что «хвост» неадсорбированных белков при величинах а несколько выше нуля может быть причиной значительного перекрывания пиков в случае Б.
можности хроматографии, ее часто используют для снижения общего количества белка, с которым работают дальше.
В промежуточных случаях, когда величина а изменяется от <0,5 до 0,9 (величины ниже 0,5 можно отнести к рассмотренной выше группе, так как большая часть фермента будет элюироваться вместе с неадсорбированной фракцией, если объем наносимого образца не слишком мал, — рис. 4.3), значительная задержка нанесенного фермента может привести к полному отделению его от неадсорбированной фракции, но элюирование все же обычно происходит в исходном буфере. На рис. 4.18 показаны два примера результатов, получающихся при а = 0,5; 'разделение в основном зависит от соотношения объемов колонки и наносимого образца. Следует отметить, что общий объем •буфера, в котором элюируется фермент, будет по меньшей мере равен объему наносимого образца, даже если не наблюдается образования «хвоста» из-за разброса величин Кр. На практике разброс значений Кр (а следовательно, и а) приводит к тому, что элюирующий объем оказывается даже больше. Тем не менее, если при работе с большим объемом элюированного фермента не возникает трудностей, этот простой хроматографический метод без смены буферов может дать хорошую очистку белков с величиной а больше 0,5, но меньше 0,9.
