Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
10 мг-мл-1. „С первого взгляда может показаться странным, что на количество неадсорбируемого белка также накладываются ограничения. Но следует помнить, что неадсорбируемый белок несет противоположно заряженные ионы, которые повышают ионную силу, ослабляя взаимодействия, необходимые в процессе нанесения образца.
Обычно допускают, что в условиях адсорбции белок связывается с верхним слоем адсорбента в колонке и остается там до тех пор, пока не изменяется состав буфера и не начинается процесс элюции. Это действительно имеет место, если а =1,0 или очень близко к этой величине. Но иногда невозможно достичь такого состояния. Нужная величина pH может не совпадать с областью стабильности фермента, или выбраны такие условия, при которых снижена общая адсорбция белка в колонке. Представим ситуацию, когда а = 0,90. В любой точке колонки, достигнутой белком, 10% этого белка остается в растворе и проходит вниз по колонке к следующей точке. Кроме того, определенная доля адсорбированного белка постоянно десорбируется и переносится вниз потоком буфера. В среднем каждая молекула белка двигается вниз по колонке со скоростью, составляющей 10% скорости буфера, поэтому белок начинает выходить из колонки после того, как на нее наносят объем буфера, равный 10 объемам колонки.
Если в наносимой на колонку смеси имеются сильно связываемые белки, то белок с величиной а, равной 0,90, будет перемещаться еще быстрее, поскольку после вытеснения из первоначальных центров связывания в верхней части колонки он окажется в области, где большая часть центров связывания будет необратимо занята другими белками. Белок будет двигаться с буфером дальше вниз по колонке в область, которую еще не достигли другие белки. Ясно, что в этих условиях объем наносимого буфера не должен значительно превышать объем колонки, и не следует слишком сильно промывать колонку исходным буфером перед началом элюции. При работе со сложными смесями окрашенных белков в верхней части колонки обычно можно наблюдать появление окрашенных зон по ме* ре того, как отдельные компоненты смеси вытесняют друг друга в соответствии с их коэффициентами распределения. Эти зоны
Разделение белков путем адсорбции
125*
становятся особенно четкими после нанесения всего количества белка и промывки колонки одним или двумя объемами исходного буфера.
Объем и размеры колонки
Минимальная величина колонки, несомненно, определяется концентрацией белка и соотношением объемов колонки и образца. Но более важными параметрами являются фактическая емкость колонки для адсорбируемых белков и длина пути, необходимая для их хроматографического разделения (о последнем-параметре иногда говорят, что он эквивалентен определенному числу «теоретических тарелок»). В некоторых случаях, особенно при ступенчатой и аффинной элюции, можно использовать короткую колонку, в которой половину объема занимает первоначальная зона адсорбированного образца. Так как при ступенчатой элюции не требуется полного хроматографического' разделения, для снижения диффузии лучше уменьшить «неиспользуемый» объем колонки. Однако при ступенчатой элюции1 редко встречаются ситуации типа «все или ничего» (а= 1,0 или а = 0), поэтому на профиль элюции будет оказывать влияние частичное удерживание белков в «неиспользуемой» нижней части колонки. Для более тонкой элюции с использованием градиентов нужна колонка, длина которой в 5—20 раз превышала-бы длину колонки, необходимой для адсорбции.
Адсорбционная емкость ионообменников в отношении белков может быть очень высокой, но она зависит от размера молекул. Молекулы небольших белков связываются в количествах, превышающих 100 мг*см_3, но очень крупные белки (мол. масса >106) не могут пройти внутрь частиц адсорбента и связываются только с его поверхностью. Поэтому емкость cqp6eH-тов для таких белков очень низка (разд. 4.2) [38, 41]. Трудно* a priori предсказать, какое количество адсорбента необходимо для первоначальной адсорбции белков. Для сложных смесей можно использовать в среднем 30 мг*см~3, но распределение компонентов в колонке вполне может быть неравномерным. Помимо эффекта образования окрашенных зон, о чем упоминалось выше, относительно высокая степень эксклюзии (исключения) крупных молекул приводит к тому, что последние занимают большую часть колонки, чем то же количество белков с небольшим размером молекул. Когда известен состав наносимой фракции в отношении размеров молекул (например, фракция после гель-фильтрации; разд. 5.1), тогда легче можно оценить возможную емкость ионообменника. Пользуясь общими? цифрами, приведенными выше, можно подсчитать, что есл№ имеется 1 г белка и ожидается, что половина его адсорбиру-
126
Глава 4
Рис. 4.17. Колонки, имеющие одинаковый объем, но разные пропорции. Л. Длинная и узкая колонка, в которой белок адсорбируется в верхней части, занимающей 20% объема;
ттмт
она характеризуется относительно низкой скоростью потока, причем неравномерность потока обычно не важна. Б. Короткая колонка, для которой характерна высокая скорость потока и быстрое разделение; в данном случае необходим равномерный поток по всему поперечному сечению, в противном случае разрешение ухудшается (см. также рис. 5.9).
