Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Таблица 4.6. Состав буферов для ионообменной хроматографии*>
Анионообмен2)
Температу pH Буфер
ра, °С
20 8,5-9,2 ) Диэтаноламин или 2-амино-2-метил-
0 9,0---9,7 / 1,3-пропандиол
20 7,8-8,5 1 Трис9)
0 8,2---8,9 /
20 7,4---8,0 \ Триэтаноламии
0 7,8---8,4 /
20 6,6---7,3 ) Имидазол4)
0 7,0---7,7 /
20 6,2-6,8 \ Бис-трис10>
0 6,5---7,1 /
20 5,6---6,3 \ Гистидин4)
0 5,9---6,6 /
20 4,9---5,6 \ Пиридин5' 6)
0 5,2-5,9 /
Катионообмен3)
Температура» °С
рн
Буфер
0-^0 3,6---4,3 Молочная кислота
0---30 4,3---5,2 Уксусная кислота5>
0---30 4,7---5,4 Пивалиновая кислота'^
тилуксусная кислота)
0---20 5,2---5,8 Пиколиновая кислота7*
20 5,8---6,6 \ МЭС8)
0 6,0-6,8 /
20 6,3---6,9 \ АДА
0 6,5---7,1 }
20 6,8---7,5 \ мопс8>
0 7,1-7,8 /
20 7,2---7,8 ) ТЭС 8)
0 7,6-8,2 /
20 7,8---8,5 1 Трицин8)
0 8,2-8,9 j
(триме-
‘) Все перечисленные буферы имеют ионную силу 0,01. Используемые величины pH отклоняются не более чем на 0,4 ед. от рКа.
2) 10 мМ HCI, доведенный до нужного pH оснбвной формой буфера.
3) 10 мМ КОН, доведенный до нужного pH кислой формой буфера.
4) Образуется комплекс с двухвалентными металлами (особенно гистидин).
5) Летучий.
6) Токсичный.
7) Поглощает в УФ.
8) Полные названия цвиттерионных буферов см. в табл. 6.3.
9) Трис(гидроксиметил)аминометан.
,0) Бис(2-гидроксиэтил)имино-трис(гидроксиметил метан).
Разделение белков путем адсорбции
123
Ц1ию буфера. Последний способ может быть неприемлем из-за высокой стоимости некоторых необычных буферных смесей. Более высокая буферная емкость позволяет надежно поддерживать нужное значение pH и проводить элюцию путем изменения pH (разд. 4.2). (Обсуждение величин pH и состава буферов будет продолжено в разд. 6.1.)
Условия адсорбции
Когда выбран нужный буфер, следует подумать об условиях нанесения белка на колонку, а также о том, каковы должны быть ее размеры при данном количестве белка и какие еще процедуры могут понадобиться. Как правило, наносимая на колонку белковая смесь должна быть растворена в том же буфере, который используют для уравновешивания колонки. Если же в этом нет необходимости, поскольку интересующий нас фер* мент хорошо связывается с адсорбентом, то тем лучше — не нужно тратить время на перенос образца в определенный буфер. Однако значение pH белкового раствора должно быть идентично pH буфера, уравновешивающего колонку. Желательно также, чтобы ионная сила образца была близка к ионной силе буфера. Существует два способа, с помощью которых можно получить буфер требуемого состава: диализ и гель-
фильтрация. Диализ является традиционным методом, и, хотя •его проведение занимает много времени, он не трудоемок. В настоящее время чаще используется, особенно при работе с небольшими объемами, обессоливание методом гель-фильтрации. Эт(И процессы описывались в разд. 1.4.
Теперь образец белка растворен в подходящем для нанесения на ионообменную колонку буфере. Единственное, что остается сделать, это довести концентрацию белка до нужной величины. Даже после удаления солей и других манипуляций концентрация белка может достигать 30 мг-мл-1. Это очень высокая концентрация, особенно если на ионообменнике адсорбируется значительная часть белка. Ионы буфера вовлекаются в ионный обмен, и быстрое замещение противоионов молекулами белка может привести к резкому локальному изменению pH и концентрации соли (разд. 4.2). Любые тщательно подбираемые условия должны быть воспроизводимыми; вместе с тем, хотя нанесение образца с высокой концентрацией белка иногда дает хорошие результаты в том или ином конкретном случае, воспроизводимость может оказаться низкой. Часто условия, хорошо воспроизводимые при повседневной работе в одной лаборатории, очень трудно воспроизвести в другой. Поэтому лучше пользоваться методами, не очень сильно зависящими от точ-
124
Глава 4
ного значения какого-либо одного параметра. Чем больше раз-ведение наносимого на колонку образца, тем более воспроизводимыми будут результаты. Однако работать с сильно разбавленными растворами неудобно, и их использование может породить другие проблемы, особенно если величина а выделяемого фермента ниже 0,95 (см. ниже).Максимально допустимая концентрация адсорбируемого белка составляет 5 мг*мл_1при наличии в смеси неадсорбируемого белка в концентрации
